microRNA在结肠癌上皮间质转化中的作用与机制研究

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转移是导致结肠癌预后不良的关键问题,超过三分之一的结肠癌患者最终会发生转移,给临床治疗带来极大困难,严重影响患者的疗效和生存质量。上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是导致肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键步骤。最新的研究显示EMT是肿瘤转移的关键启动步骤,而EMT在结肠癌进展中发挥着主导作用。深入研究结肠癌EMT发生的分子机制,寻找可以逆转结肠癌EMT的重要分子靶点,在关键步骤对结肠癌转移进行干预,理论上可更有效抑制结肠癌转移。目前已经发现了多个与结肠癌EMT与转移相关的分子,丰富了我们对于该领域的理论认识。然而,EMT相关信号通路涉及多个分子多条信号通路,任何针对单个分子的干预方法,都难以达到理想的逆转效果。因此,有必要寻找新的手段和策略。miRNA是近年来发现的一类重要的内源性非编码小RNA分子,其与肿瘤的发生发展密切相关。最近研究表明,miRNA可以通过负性调控EMT相关基因的表达,在肿瘤转移中起着重要的作用。由于单个miRNA可以同时调控多个靶基因的表达,靶向miRNA的干预理论上能更有效的逆转肿瘤EMT表型。然而,到目前为止,仅有少数miRNA被证实参与了肿瘤EMT的发生,miRNA在肿瘤尤其是结肠癌EMT中所起的作用及其分子机制还远未阐明。【目的】探讨miRNA在结肠癌EMT中的调节作用及其分子机制,以期阐明结肠癌EMT机制,为干预结肠癌转移提供新的理论依据。【方法】1.利用免疫荧光、real-time RT-PCR及western blotting技术鉴定多种结肠癌细胞系EMT表型,筛选结肠癌EMT表型差异细胞模型;2.采用MiRNA芯片技术筛选结肠癌EMT相关的差异表达miRNA分子,并利用real-time RT-PCR对miRNA芯片结果进行验证;3.收集结肠癌组织标本,采用real-time RT-PCR检测候选miRNA的表达,并探讨其表达水平与临床病例参数的关系;4.采用transwell实验检测候选miRNA对结肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响,采用免疫荧光、real-time RT-PCR及western blotting技术检测候选miRNA对细胞骨架与EMT相关标志分子表达的影响;5.采用生物信息学预测候选miRNA的潜在靶基因,并进一步利用Westernblotting、qRT-PCR和双荧光素酶报告基因实验进行验证;6.采用免疫组织化学技术检测靶基因在结肠癌标本中的表达,并探讨其与临床病理参数之间的相关性;7.采用transwell实验、免疫荧光染色、real-time RT-PCR及western blotting技术验证靶基因对结肠癌EMT表型的影响。【结果】1、结肠癌高低转移细胞系SW480和SW620具有明显的EMT表型差异。SW480和SW620是一对具有相同遗传背景的结肠癌高低转移细胞系。免疫荧光染色结果显示,相对于SW480细胞,SW620细胞骨架呈明显的间质样形态,上皮标志分子E-cadherin分子的表达明显下调;Western blotting和real-time RT-PCR结果显示SW620间质标志分子Vimentin表达明显上调,E-cadherin表达明显下调。2、EMT相关的miR-185在结肠癌中明显下调,并与结肠癌进展密切相关。EMTmiRNA芯片筛选(SW480和SW620)获得了多个与结肠癌EMT相关的差异表达miRNA分子,其中miR-185是在SW620中下调最明显的分子;real-time RT-PCR结果表明miR-185在SW620中明显下调,与芯片结果一致,在90例结肠癌临床标本中,miR-185的表达水平与结肠癌患者的淋巴结转移状况以及TNM分期显著相关。3、miR-185抑制结肠癌细胞侵袭和迁移能力,逆转EMT表型。在SW480中抑制miR-185的表达和在SW620细胞中升高miR-185的表达后进行transwell实验,结果表明miR-185可以明显抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。此外,在SW620中过表达miR-185后,免疫荧光染色显示SW620细胞骨架形态由间质样变为上皮样,Western blotting和real-timeRT-PCR结果显示SW620细胞中上皮标志分子的表达明显上调,间质标志分子的表达明显上调。4、间质交互分子1(STIM1)是miR-185的直接功能靶基因。采用多个生物信息学软件预测miR-185的潜在靶基因,取交集,并进行功能聚类分析和通路分析,初步选定钙信号关键分子STIM1为miR-185的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示miR-185可以通过直接结合于STIM1mRNA的3’UTR抑制荧光素酶活性。Western blotting和qRT-PCR结果显示相对于SW480,STIM1在SW620细胞系中明显上调。此外,在SW480中抑制miR-185的表达,STIM1的表达随之上调,在SW620细胞中升高miR-185的表达后,STIM1的表达随之下调。补救实验显示在SW620细胞中,3’UTR突变的STIM1表达载体可以逆转miR-185的表型抑制效应,说明STIM1是miR-185发挥功能的主要靶基因。5、STIM1在结肠癌标本中过表达,其表达水平与miR-185水平呈负相关,并与结肠癌进展密切相关。采用免疫组化染色检测STIM1在上述90例结肠癌标本中的表达,结果显示,相对正常的癌旁组织,STIM1在结肠癌标本中的表达明显上调,统计学分析发现,STIM1的表达水平与miR-185水平呈负相关,并与结肠癌淋巴结转移状况及TNM分期显著相关。6、STIM1促进结肠癌细胞粘附、侵袭与迁移能力,诱导EMT。在SW620细胞中用特异性的小干扰RNA下调STIM1的表达后,粘附实验和transwell实验结果显示,细胞的粘附、侵袭与迁移能力明显减弱,免疫荧光、western blotting和qRT-PCR结果显示,细胞的EMT表型被逆转。【结论】1、多个miRNA在结肠癌EMT表型差异细胞模型中呈差异表达,可能在结肠癌EMT中起重要作用;2、miR-185参与调控结肠癌EMT表型,其分子机制可能是:miR-185通过负性调控靶基因STIM1的表达,从而影响结肠癌细胞钙离子信号的失调,继而引起下游信号通路的异常,从而导致EMT表型的改变;3、miR-185及其靶基因STIM1在结肠癌组织的表达水平与结肠癌进展密切相关,二者可能成为新的结肠癌分子标志物。
缩略语表第6-8页
中文摘要第8-12页
英文摘要第12-20页
前言第21-23页
文献回顾第23-36页
实验一 结肠癌 EMT 相关 miRNAs 的高通量筛选第36-54页
    引言第36-37页
    1 实验材料第37-38页
    2 实验方法第38-41页
    3 实验结果第41-50页
    4 讨论第50-54页
实验二 miR-185 在结肠癌中的表达及其调控 EMT 的功能研究第54-69页
    引言第54-55页
    1 实验材料第55-56页
    2 实验方法第56-58页
    3 实验结果第58-66页
    4 讨论第66-69页
实验三 miR-185 调控结肠癌 EMT 的机制研究第69-88页
    引言第69页
    1 实验材料第69-71页
    2 实验方法第71-73页
    3 结果第73-85页
    4 讨论第85-88页
小结第88-89页
参考文献第89-100页
个人简历和研究成果第100-102页
致谢第102-103页
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