背景正常骨骼的骨形成与骨吸收相互偶联,保持动态平衡。骨重建失衡,即骨吸收增强和/或骨形成减少,就会引起骨量丢失,这见于多种成年人常见骨骼疾病,如骨质疏松、类风湿性关节炎、关节无菌性松动症、骨转移癌和牙周炎等。破骨细胞分化与功能增强是导致这些疾病骨质破坏的关键。至今还没有一种单一的药物在抑制骨吸收的同时促进骨生成。抗骨吸收或者促骨合成的药物,尤其是具有抗吸收和促合成双重作用的药物,对骨质疏松症的防治具有远大前景。大量研究证实,包括核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)在内的一些细胞因子可以诱导绝经后骨质疏松症及炎性关节炎患者的骨量流失。在用可与其受体相互作用的TNF受体相关因子(TNF receptor-associated factor,TRAF)配体蛋白预处理后,RANKL和TNF可以在体外独立诱导野生型(wild type,WT)小鼠破骨细胞前体向破骨细胞的分化。在这些配体蛋白中,只有TNF受体相关因子6(TNF reseptor-associated factor 6,TRAF6)在RANKL诱导的体外破骨细胞生成中是必需的,但是其分子机制并不完全清楚。目的本课题将进一步深入研究TRAF6及TRAF3在TNF和RANKL诱导的破骨细胞(osteoclast,OC)形成和激活中的作用,探索TRAF6是否参与TRAF3的降解过程及其作用机制。方法(1)我们采用TRAF6+/-小鼠与129小鼠杂交后所产的TRAF6-/-小鼠作为实验动物。观察TRAF6-/-小鼠和同窝WT小鼠次级骨化中心及干骺端破骨细胞数量。(2)收集9-16天大的TRAF6-/-小鼠和同窝野生型小鼠脾细胞在体外进行细胞培养,培养过程中加入RANKL、TNF或RANKL+TNF,加或不加不同的抑制因子。培养2-4天后在倒置显微镜下观察破骨细胞的数量、面积及骨吸收陷窝面积。将培养的成熟的破骨细胞固定后用DAPI复染,在荧光显微镜下观察肌动蛋白环。(3)收集9-16天大的TRAF6-/-小鼠和同窝野生型小鼠脾细胞在体外进行细胞培养,培养过程中加入RANKL、TNF、RANKL+TNF、TNF+TGFβ1(转化生长因子β)或RANKL+TGFβ1后,分为氯喹组及PBS对照组,观察破骨细胞的数量及面积;并采用Western Blot检测TRAF6-/-和WT破骨细胞前体在不同因子刺激下的TRAF3水平;用ELISA检测各组细胞培养基中的TNF及TGFβ1水平;用ELISA检测TRAF6-/-和WT小鼠骨裂解液中TNF及TGFβ1水平。为了探索TRAF3是否是TRAF6-/-小鼠中TNF诱导OCs生成过程中的重要抑制剂,我们采用LyMcre-TRAF3f/f与WT OCPs进行体外培养,培养过程中加入上述不同的刺激因子,观察形成的破骨细胞数量及面积。此外,我们用GFP或TRAF3逆转录病毒感染TRAF6-/-和WT OCPs后,加入上述不同的刺激因子进行细胞培养,观察形成的破骨细胞数量及面积。(4)所有实验均要重复3次,结果均用(?)±S表示。两组比较用非配对t-检验,3组或3组以上的比较用单因素方差分析和Dunnett Post-Hoc多重比较。p<0.05作为具有统计学差异的标准。结果(1)TRAF6-/-小鼠胫骨表面可见TRAP+多核OC,其数量为WT小鼠的1/4;在塑料平板上,RANKL不能诱导TRAF6-/-OCP向OC的分化,TNF可以诱导来自TRAF6-/-OCP的OC形成,其数量与同窝WT小鼠的数量无差异,RANKL可增强TNF诱导的破骨细胞生成。(2)在骨片上,RANKL可以诱导来自TRAF6-/-OCP的OC生成,其诱导产生的OC数量低于WT同窝小鼠的3-4倍;由RANKL诱导的来自于TRAF6-/-OCP的OC可以造成骨吸收,其骨吸收陷窝的面积要比WT组少。(3)在骨片上,TNF抑制剂和TGF-β抗体可以显著减少RANKL诱导的来自TRAF6-/-OCP的OC生成;用PBS在骨片中培养TRAF6-/-OCP和WT OCP,其培养基中的TNF水平明显高于在平板中培养的细胞,加入RANKL对该结果无明显影响,在平板培养的WT细胞培养液中,RANKL处理组的活化TGF-β水平明显高于PBS对照组;取10天大的TRAF6-/-和WT小鼠下肢骨组织裂解物,两组TNF水平无差异,且接近最低检测值,TRAF6-/-组TGF-β水平显著高于WT组。(4)TRAF3的基础水平在TRAF6-/-破骨细胞前体(Osteoclast precursors,OCP)和WT OCP中无差异;TNF显著增加TRAF3蛋白水平,TNF增加的TRAF3水平在TRAF6-/-OCP和WT OCP中无差异;RANKL降低TRAF3蛋白水平;加入RANKL后,在TRAF6-/-和WT细胞中,TNF诱导的TRAF3蛋白水平增加效应减弱。氯喹可以提高基础TRAF3水平,抑制RANKL介导的TNF诱导的TRAF6-/-OCP中TRAF3水平减少,氯喹可以完全阻断由TNF或TNF+TGFβ1或TNF+RANKL诱导的来自于TRAF6-/-小鼠OCP的OC生成。(5)与WT OCP相比,RANKL可以诱导TRAF3 cKO OCP形成更多的OC;与WT同窝小鼠细胞相比,TNF单独可以诱导更多来自于LyMcre-TRAF3f/f OCP的OC生成,并可显著提高OC面积。TRAF3过表达可显著减少WT OCP中RANKL、TNF和RANKL+TNF诱导的OC生成;TRAF3过表达可以完全阻止TRAF6-/-OCP中TNF或TNF+RANKL诱导的OC生成。结论1.RANKL可增强TNF诱导的TRAF6-/-OCP向OC的分化,促进骨吸收。2.在TNF和TGFβ的作用下,RANKL可促进TRAF6-/-OCP形成破骨细胞和骨吸收陷窝。3.TRAF3抑制TNF诱导的来自TRAF6-/-OCP的OC形成。