肝癌抑癌基因甲基化及胆汁甲基化谱的研究

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肿瘤的发生是遗传因素与环境因素共同作用的结果,其中抑癌基因的失活是细胞发生癌变的重要机制。以基因甲基化为主的DNA表观遗传修饰不仅在肿瘤细胞的起始和进展过程中起重要作用,同时,这些肿瘤表观遗传学的研究成果也有望用于肿瘤的诊断或分型等临床领域。本研究的目的就是尝试将肿瘤表观遗传学研究的基础理论和分析技术应用于肝胆相关肿瘤的临床实践,主要包括以下三方面内容:首先探讨了体液中游离DNA甲基化做为一种新型生物标志物用于肿瘤辅助诊断及预后评估的可行性;然后以SPARC基因为代表,进一步分析了抑癌基因甲基化及其失活在肝癌发生中的生物学作用;最后以丹参酮ⅡA为例,探讨了中药对于逆转抑癌基因甲基化及改善肝癌细胞恶性表型的效果和作用机制。实验第一部分目的为检测血浆游离DNA的抑癌基因甲基化,筛选肝癌特异的甲基化标志物,并评价其临床意义。收集55例肝癌和54例慢性肝病患者血浆标本,应用甲基化特异性PCR方法检测血浆游离DNA的12个抑癌基因甲基化状态,比较两组间各基因甲基化的差别。可见,APC、Cyclin D2、TFPI2、DKK3和GSTP1基因在肝癌组中的甲基化频率高于慢性肝病组(P<0.01,Chi-square或Fisher确切检验),这些基因的甲基化具有肝癌特异性,将它们组成5基因甲基化谱,以甲基化指数表示甲基化谱的总体甲基化程度,肝癌组甲基化指数(中位值为0.6,IQR 0.4-0.8)显著高于慢性肝病组(中位值为0.2,IQR 0-0.2,秩和检验)。该甲基化谱可能成为肝癌辅助诊断的核酸标志物。实验第二部分旨在探讨SPARC基因在肝癌中的失活机制和甲基化状态。使用特异性去甲基化药物5-氮-2’-脱氧胞苷作用于肝癌细胞系SMMC-7721,应用甲基化特异性PCR、PCR(?)产物克隆测序、逆转录PCR、免疫细胞化学染色等方法检测SPARC基因的甲基化状态及基因mRNA、蛋白质表达的变化。进而在肝癌和癌旁组织中检测SPARC的甲基化频率、mRNA及蛋白质表达,分析该基因甲基化状态与表达及临床资料的相关性。结果显示,在肝癌细胞系中,5-氮-2’-脱氧胞苷可以逆转SPARC的甲基化状态,恢复基因表达。肝癌组织中SPARC的甲基化频率(75.00%)显著高于癌旁组织(11.67%,Chi-square检验),肝癌组织中甲基化阳性病例的mRNA表达量低于阴性病例(P=0.040,秩和检验)。SPARC甲基化状态与肝癌病理分级及患者总体生存期相关。SPARC基因在肝癌细胞中以高甲基化为失活方式,该基因甲基化在肝癌中为高发事件,并与肝癌预后相关,可作为肝癌预后评估的候选标志物。DNA异常甲基化是一个可逆的过程,对抑癌基因进行去甲基化可能成为肝癌治疗的新途径。为探讨中药丹参酮ⅡA对肝癌细胞的去甲基化作用。本实验以丹参酮ⅡA作用于SMMC-7721细胞,对作用后的细胞进行存活率、细胞形态、甲基化谱、基因转录和蛋白表达等检测。结果显示,丹参酮ⅡA可抑制肝癌细胞生长、增加细胞凋亡率,可逆转抑癌基因的甲基化状态,恢复基因表达。并且,丹参酮ⅡA可引起细胞DNA甲基转移酶Ⅰ表达下调,提示该药通过下调DNA甲基转移酶Ⅰ的表达而影响细胞DNA的甲基化过程。为验证胆汁中游离DNA甲基化是否可作为恶性肿瘤特异性的标志物,本实验收集80例肝外胆管梗阻患者的胆汁,提取游离DNA,应用甲基化特异性PCR的方法检测了19个抑癌基因的甲基化状态,其中DKK3、p16、SFRP2、DKK2、NPTX2及ppENK基因的甲基化频率在恶性组中显著高于良性组。将它们组成的甲基化谱作为生物标志物,用于鉴别良、恶性胆管梗阻,可使诊断的敏感性、特异性和准确性分别达到77.27%、77.78%和77.50%。提示胆汁游离DNA甲基化具有肿瘤特异性,可作为恶性胆管梗阻辅助诊断的标志物。综上所述,本研究表明血浆或胆汁中游离DNA的抑癌基因甲基化具有肿瘤特异性,以多基因甲基化谱作为生物标志物,可用于相关肿瘤的辅助诊断;肝癌细胞中SPARC基因的高甲基化是其主要失活方式并具有组织特异性,可作为肝癌辅助诊断及预后评估的候选标志物;中药丹参酮ⅡA可通过下调肝癌细胞DNA甲基转移酶表达逆转抑癌基因的甲基化状态,抑制肝癌细胞生长和促进细胞凋亡。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-8页
目录第9-11页
缩略语第11-12页
前言第12-20页
    研究现状、成果第12-15页
    研究目的、方法第15-20页
一、肝癌血浆游离DNA甲基化谱检测及临床意义第20-39页
    1.1 材料和方法第20-26页
        1.1.1 实验材料第20-22页
        1.1.2 实验方法第22-26页
    1.2 结果第26-35页
    1.3 讨论第35-38页
    1.4 小结第38-39页
二、肝癌SPARC异常甲基化及其临床意义第39-58页
    2.1 材料和方法第39-47页
        2.1.1 实验材料第39-41页
        2.1.2 实验方法第41-47页
    2.2 结果第47-55页
    2.3 讨论第55-57页
    2.4 小结第57-58页
三、丹参酮ⅡA对肝癌细胞SMMC-7721去甲基化作用的研究第58-77页
    3.1 材料和方法第58-63页
        3.1.1 实验材料第58页
        3.1.2 实验方法第58-63页
    3.2 结果第63-73页
    3.3 讨论第73-76页
    3.4 小结第76-77页
四、胆汁游离DNA甲基化谱检测及其临床意义第77-89页
    4.1 材料和方法第77-80页
        4.1.1 实验材料第77页
        4.1.2 实验方法第77-80页
    4.2 结果第80-86页
    4.3 讨论第86-88页
    4.4 小结第88-89页
全文结论第89-91页
论文创新点第91-92页
参考文献第92-97页
发表论文和参加科研情况说明第97-98页
附图第98-116页
综述 抑癌基因甲基化与恶性肿瘤的相关研究第116-136页
    综述参考文献第128-136页
致谢第136页
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