背景:嗜麦芽窄食单胞菌(Stentrophomonas maltophilia,S.maltophilia)是一种多重耐药(Multidrug-Resistant,MDR)的机会致病菌,广泛存在于自然界,可在社区和医院引起多种严重的感染。医院内嗜麦芽窄食单胞菌感染的机率逐年升高,尤其是免疫力低下的患者更易被该菌感染,急需防治嗜麦芽窄食单胞菌感染的新方法。大量研究表明外膜蛋白作为抗原用于免疫可有效的抵抗细菌的感染,但到目前为止关于嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白免疫保护性的研究甚少。本课题组前期通过免疫蛋白质组学筛选出具有较强免疫原性的嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A(Outer membrane protein A,Omp A),但Omp A是否可以作为防治嗜麦芽窄食单胞菌感染的亚单位疫苗候选分子仍不清楚。本研究我们将通过生物信息学技术对嗜麦芽窄食单胞菌Omp A的结构及特征进行预测分析,并通过实验评价粘膜免疫r Omp A对小鼠嗜麦芽窄食单胞菌感染的免疫保护作用。第一部分嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A的生物信息学分析目的:对嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A(Omp A)的结及特征进行生物信息学预测与分析。方法:利用生物信息学软件和生物数据库对Omp A蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、二级和三级结构、同源性、保守结构域及抗原决定簇等进行预测分析。结果:Omp A蛋白为亲水性蛋白,1~22位氨基酸为该蛋白的信号肽序列,Omp A蛋白没有跨膜结构并定位于细胞膜外;该蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、β-转角、β-片层所占的比例分别为50.27%,24.59%,9.29%,15.85%;三级结构预测Omp A蛋白为桶状蛋白;Omp A蛋白在不同嗜麦芽窄食单胞菌株间高度保守,而在人和小鼠的蛋白序列进行比对分析中没有发现同源序列;Omp A蛋白保守结构域在N-端为OM膜通道蛋白超家族(OM-channels superfamily),在C-端为Omp A_C超家族(Omp A_C-like superfamily);Omp A蛋白含有11个优势抗原决定簇区域。第二部分嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A粘膜免疫保护性的研究目的:对粘膜免疫重组外膜蛋白A(r Omp A)诱导小鼠产生的免疫应答及对小鼠嗜麦芽窄食单胞菌感染的免疫保护效果进行评价。方法:制备重组蛋白rOmp A,将其做为抗原通过滴鼻的方式免疫小鼠。用ELISA法检测抗体的水平及体外再刺激后脾细胞分泌的细胞因子的水平,对粘膜免疫r Omp A诱导小鼠产生的免疫应答进行评价。用嗜麦芽窄食单胞菌通过滴鼻的方式攻毒免疫后的小鼠,攻毒后24h取小鼠肺组织,研磨后涂板计算肺组织细菌载量,ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子的水平,对粘膜免疫r Omp A对小鼠嗜麦芽窄食单胞菌感染的免疫保护效果进行评价。结果:在没有使用免疫佐剂的情况下,用r Omp A滴鼻免疫小鼠可诱导小鼠产生持续的系统性和局部粘膜性的抗体免疫应答。用r Omp A体外再刺激从免疫小鼠分离的脾细胞,发现r Omp A免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ,IL-2及IL-17A水平比单独免疫PBS组小鼠脾细胞分泌的水平明显更高。用嗜麦芽窄食单胞菌滴鼻攻毒小鼠后24h,发现r Omp A免疫组小鼠肺组织细菌载量及支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症因子(TNF-α和IL-6)水平与PBS组小鼠相比明显更低,提示滴鼻免疫r Omp A可保护小鼠抵抗嗜麦芽窄食单胞菌的感染。结论:(1)通过对嗜麦芽窄食单胞菌Omp A蛋白进行生物信息学分析,成功获得了该蛋白的一般特性,为进一步研究该蛋白的结构、特征提供参考,为研制相关亚单位疫苗提供理论依据。(2)实验研究发现粘膜免疫r Omp A可诱导小鼠产生持续的系统性和局部粘膜性的体液免疫应答,并且可诱导小鼠产生Th-1,Th-17型细胞免疫应答;此外还发现滴鼻免疫r Omp A可保护小鼠对抗嗜麦芽窄食单胞菌的感染,提示Omp A可以作为防治嗜麦芽窄食单胞菌感染的亚单位疫苗候选分子。
