中国柑橘黑斑病相关的叶点霉属真菌种类、遗传多样性和快速诊断技术研究

柑橘黑斑病论文 Phyllosticta论文 种类鉴定论文 种特异性引物论文 巢式多重PCR论文
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柑橘黑斑病(Citrus Black Spot, CBS),也称黑星病,病原的有性态为柑橘球座菌(Guignardia citricarpa Kiely),属子囊菌门,座囊菌目;无性态为柑橘叶点霉菌(Phyllosticta citricarpa (McAlpine) van der Aa),属半知菌类,腔孢纲,球壳孢目。病菌主要危害果实,在果皮上形成病斑导致鲜果的商品性下降,甚至无法上市鲜售。CBS病菌被欧盟列为A1类严禁入境的有害生物,也是美国严禁入境的有害生物,因此是包括我国在内有黑斑病发生国家柑橘鲜果出口的重要障碍。尽管我国是柑橘的原产地之一,栽培柑橘种类繁多,黑斑病发生普遍,但对不同类型柑橘的黑斑病菌病原种类是否一致,以及病菌的生物学特性和分子变异并无研究。本研究从我国柑橘主产区几大栽培柑橘上收集黑斑病或疑似黑斑病症状的果实和叶片,分离培养获得代表性菌株若干,在此基础上开展这些代表性菌株的种类鉴定、种内遗传多样性分析,以及种特异性引物的筛选和相关的PCR鉴定体系的建立。主要研究结果如下:1.建立了P. citriasiana的分子鉴定技术在ITS1区域设计了针对于亚洲柑橘叶点霉菌P. citriasiana的特异性上游引物Pca8,结合下游引物ITS4,建立了准确、灵敏和快速鉴定P. citriasiana的PCR体系。利用该体系可从P. citriasiana菌株中扩增出488bp的特异性条带,而不能从柑橘叶点霉菌P. citricarpa和首都叶点霉菌P. capitalensis(-一种内生菌),以及其他柑橘常发病害病原菌中扩增出条带。该体系检测P. citriasiana DNA最低为12pg,整个过程可在3小时内完成。2.明确了中国柑橘上叶点霉属真菌种类自2007-2011年,从我国10个省市的宽皮橘(Citrus reticulata)、柚(C. maxima)、葡萄柚(C. paradisi)、甜橙(C. sinensis)以及柠檬(C. limon)等具典型或非典型黑斑病症状的果实和叶片上分离获得496个Phyllosticta菌株。通过形态学比较,可将这些菌株分为4类。选择74个代表性菌株,克隆测定其18S rDNA和28S rDNA的部分区域、核糖体DNA的两个转录间隔区及其中的5.8S亚基(internal transcribed spacer, ITS)、肌动蛋白(Actin,ACT),延长因子(translation elongation factor-1alpha, TEF1),β微管蛋白(β-tubulin, Tub)和钙调蛋白(calmodulin, Cal)基因的部分序列,单独或合并后构建系统进化树,结果发现这74个菌株分为4个明显的分支。其一为P. citricarpa,即被欧盟和美国列为检疫对象的柑橘叶点霉菌。该病菌的寄主有宽皮橘、甜橙和柠檬,但没有从柚上发现;其二为P. citriasiana,引起柚黑斑病(也被称为棕褐斑病,‘’tan spot"),寄主为沙田柚和琯溪蜜柚,但未从其他柑橘种上发现;其三是P. capitalensis,即一种内生菌,可从本研究中的各种柑橘的有症或无症材料上获得;其四是一个有别于已有的Phyllosticta spp.,本文暂时将之定为Phyllosticta citrichinaensis X.H. Wang, K.D. Hyde&H.Y. Li。该菌可从本研究中的各种柑橘的非典型黑斑病症状的材料上获得。在这4个Phyllosticta spp中,P. citrichinaensis的分生孢子最小,附属丝最长,短杆状孢子和子囊孢子最大;P. citrichinaensis在PDA, CMA和MEA培养基表面形成具有多个环形凹槽的菌落,在OA培养基上不产生黄色素;当以葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖分别作为唯一碳源时,P.citrichinaensis生长较差,菌落直径小于其他三种Phyllosticta;当以尿素、酒石酸铵、天门冬氨酸、乙酸铵、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、胰蛋白胨、脯氨酸、甘氨酸分别作为唯一氮源时,P. citrichinaensis生长最差,菌落直径均小于其他三个Phyllosticta种,且P. citrichinaensis几乎不能利用尿素、酒石酸铵、天门冬氨酸、乙酸铵、(NH4)2SO4、NH4NO3; P. citrichinaensis生长pH范围为3.0-6.0,最适为4.0,其次为3.0。在pH为3.0-5.0的PDA培养基上, P. citrichinaensis比P.citriasiana和P. citricarpa生长快,但比P. capitalensis生长慢。3.建立巢式多重PCR鉴定柑橘上四种叶点霉属真菌的技术体系比较4种叶点霉属真菌的ITS1及18S区域序列,设计并筛选了针对P. citrichinaensis、P. citricarpa、P. capitalensis和P. citriasiana特异性上游引物Pcc1、Pc1、Pct4和Pea8(见1),并均以通用引物ITS4作为下游引物。以已知该4种菌的菌株DNA作为对照,首先使用ITS4/ITS5对供试菌株进行第一轮扩增,PCR产物稀释50-100倍后,同时加入引物对Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pca8/ITS4,在退火温度为60℃条件下进行第二轮PCR扩增,通过扩增条带与已知种菌株的相应扩增条带大小的比较,确定待测样品所属的叶点霉属菌的种类。该体系的灵敏度达到2ag的DNA。与传统PCR相比其灵敏度至少提高106倍。不仅可用于试验室培养的待测菌株的鉴定,还可以用于果实疑似黑斑病的病斑快速鉴定。4.明确了中国柑橘叶点霉属真菌遗传多样性通过对影响PCR反应的主要成分模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶及引物等条件的优化,建立了适合柑橘叶点霉菌的ISSR-PCR反应体系。利用该体系从100条引物中筛选出11条扩增条带稳定、清晰、重复性好和多态性高的引物。利用筛选的11条引物和优化的ISSR-PCR体系,对供试的110个来自柑橘的叶点霉属菌株进行扩增,共扩增出197个条带,多态性条带为194个,多态率为98.5%,证明中国柑橘上叶点霉属真菌遗传多样性丰富。利用NTSYS-pc2.10软件对扩增的条带进行分析并构建UPGMA聚类图,显示中国柑橘叶点霉属真菌可以分为四个分支,每分支对应着P. citricarpa, P.citriasiana, P. capitalensis和P. citrichinaensis。P. citricarpa的遗传分化与寄主种类相关,而与地理来源无关。来自甜橙和柠檬的菌株与来自宽皮柑橘的菌株分布在不同的分支中,而来自砂糖橘的菌株又聚为一个分支。而P. citriasiana, P. capitalensis和P. citrichinaensis(?)中群内的遗传变异与地理距离和寄主均无相关性。
致谢第6-10页
摘要第10-13页
Abstract第13-16页
第一章 文献综述和研究背景第17-39页
    1. 柑橘黑斑病的研究背景第17-27页
        1.1 柑橘黑斑病的发生历史、国内外分布和危害性第17-20页
            1.1.1 病害的国内外发生历史第17页
            1.1.2 病害的分布第17-18页
            1.1.3 病害的危害性及病害在我国的研究进展第18-20页
                1.1.3.1 病害的危害性第18-19页
                1.1.3.2 病害在我国的研究进展第19-20页
        1.2 柑橘黑斑病的症状特点第20页
        1.3 柑橘黑斑病的病原种类第20-23页
            1.3.1 柑橘叶点霉菌(P.citricarpa)和首都叶点霉菌(P.capitalensis)第20-21页
            1.3.2 亚洲柑橘叶点霉菌P.citriasiana第21-22页
            1.3.3 巴西柑橘叶点霉菌(P.citribraziliensis)第22-23页
        1.4 病害的发生规律第23-24页
            1.4.1 病害的初侵染来源第23-24页
            1.4.2 病害的传播第24页
            1.4.3 气候条件对病害流行的作用第24页
        1.5 病害的诊断与检测第24-25页
        1.6 病害的风险第25-26页
        1.7 病害的防治第26-27页
    2、叶点霉属真菌的研究进展第27-30页
        2.1 叶点霉属的建立和演变第27页
        2.2 叶点霉属真菌种的分类和种类第27-29页
            2.2.1 叶点霉属真菌种的分类依据第27-28页
            2.2.2 叶点霉属的种类第28-29页
        2.3 叶点霉属和球座菌属真菌命名第29-30页
    3、植物病原菌的分子快速诊断技术的研究进展第30-32页
        3.1 核糖体DNA的转录间隔区序列的应用第30-31页
        3.2 特异性扩增核糖体DNA内转录间隔区PCR技术及应用第31-32页
    4、植物病原真菌的种群遗传多样性及其研究技术第32-37页
        4.1 物种遗传多样性形成的原因及研究的意义第32-33页
            4.1.1 物种遗传多样性形成的原因第32-33页
            4.1.2 研究物种遗传多样性的意义第33页
        4.2 研究遗传多样性的方法第33-35页
        4.3 分子标记技术在叶点霉属真菌中的应用第35-37页
    5、本研究的背景、意义和研究内容第37-39页
第二章 中国柑橘黑斑病菌及其叶点霉属真菌的种类第39-86页
    1. 前言第39-42页
    2. 材料与方法第42-47页
        2.1 试验材料第42页
        2.2. 试验方法第42-47页
            2.2.1 菌株分离纯化第42页
            2.2.2 病原菌形态与培养性状第42页
            2.2.3 基因组DNA的提取第42-43页
            2.2.4 PCR扩增、克隆、测序和引物设计第43-44页
            2.2.5 引物筛选与引物特异性检验第44页
            2.2.6 特异性引物的灵敏度检验第44页
            2.2.7 果园疑似柚黑斑病症状的病斑检测第44-45页
            2.2.8 种特异性引物鉴定病原菌第45页
            2.2.9 代表性菌株系统进化树的构建第45页
            2.2.10 温度对四种叶点霉属真菌的生长影响第45-46页
            2.2.11 生物化学特性第46-47页
                2.2.11.1 四种叶点霉属真菌对碳源利用比较第46页
                2.2.11.2 四种叶点霉属真菌对氮源利用比较第46页
                2.2.11.3 四种叶点霉属真菌对pH的反应比较第46-47页
    3 结果与分析第47-83页
        3.1 分离结果第47页
        3.2 供试菌株的形态学鉴定第47-51页
        3.3 P.citricarpa、P.capitalensis和P.citriasiana ITS序列测定与分析及引物设计第51-53页
        3.4 引物筛选结果第53页
        3.5 灵敏度检测结果第53页
        3.6 特异性引物对果实病斑中亚洲柑橘叶点霉菌的检验第53-54页
        3.7 种特异性引物对分离菌株的鉴定结果第54-57页
        3.8 系统进化树的构建第57-68页
            3.8.1 基于ITS序列构建的系统进化树第57-63页
            3.8.2 基于肌动蛋白基因ACT构建的系统进化树第63页
            3.8.3 基于延长因子基因TEF1序列构建的系统进化树第63-66页
            3.8.4 基于β-微管蛋白基因Tub和钙调蛋白基因Cal构建的系统进化树第66页
            3.8.5 基于ITS,ACT和TEF1基因组合序列构建的系统进化树第66-68页
        3.9 叶点霉属新种Phyllosticta citrichinaensis的形态学描述第68-73页
        3.10 四种叶点霉属菌株在不同培养基上的培养性状第73-75页
        3.11 三种叶点霉属菌株在果实或叶片上引起的症状第75-79页
            3.11.1 P.citrichinaensis在柑橘果实和叶片上产生的症状第75页
            3.11.2 P.citricarpa在宽皮柑橘、甜橙和柠檬果实上引起的症状第75页
            3.11.3 P.citriasiana在柚果实和叶片上引起的症状第75-79页
        3.12 P.citrichinaensis、P.citricarpa、P.citriasiana和P.capitalensis生长温度第79页
        3.13 四种叶点霉属菌株生物学特性第79-83页
            3.13.1 四种叶点霉属菌株对不同碳源的利用情况第79页
            3.13.2 四种不同叶点霉属菌株对氮源的利用第79-80页
            3.13.3 四种叶点霉属菌株在不同pH培养基上生长状况第80-83页
    4 结论与讨论第83-86页
第三章 鉴定柑橘上三种叶点霉属真菌的特异性引物筛选和巢式四重PCR鉴定体系建立第86-100页
    1. 前言第86-88页
    2. 材料与方法第88-92页
        2.1 供试菌株及其培养第88页
        2.2 基因组DNA的提取第88页
        2.3 P.citricarpa,P.citrichinaensis和P.capitalensis特异性引物的设计第88-91页
        2.4 P.citricarpa,P.citrichinaensis和P.capitalensis引物的特异性检测及目的条带的克隆第91页
        2.5 特异性引物灵敏度检验第91页
        2.6 柑橘叶点霉属巢式PCR体系优化第91页
        2.7 果园具有疑似柑橘黑斑病症状的果实和叶片检测第91-92页
    3 结果与分析第92-99页
        3.1 特异性引物和相应的退火温度筛选第92页
        3.2 引物特异性检验第92-94页
        3.3 特异性引物灵敏度检测结果第94-96页
        3.4 巢式PCR体系优化第96-97页
        3.5 巢式多重PCR灵敏度测定结果第97-98页
        3.6 果园具有疑似柑橘黑斑病症状的果实和叶片检测第98-99页
    4 结论和讨论第99-100页
第四章 中国柑橘上的叶点霉属真菌遗传多样性研究第100-121页
    1 前言第100-102页
    2 材料和方法第102-106页
        2.1 菌株来源第102-105页
        2.2 菌丝基因组DNA的提取第105页
        2.3 ISSR反应体系的优化第105-106页
            2.3.1 ISSR反应体系各成分用量研究第105页
            2.3.2 ISSR反应程序第105页
            2.3.3 引物筛选及遗传多样性分析第105-106页
    3 结果与分析第106-119页
        3.1 叶点霉属真菌菌丝基因组总DNA的质量第106页
        3.2 反应体系优化结果第106-110页
            3.2.1 Mg~(2+)对ISSR-PCR扩增结果的影响第106-107页
            3.2.2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响第107页
            3.2.3 引物浓度对ISSR-PCR反应的影响第107-108页
            3.2.4 TaqDNA聚合酶用量对ISSR-PCR反应的影响第108页
            3.2.5 模板DNA用量对ISSR-PCR反应的影响第108-110页
            3.2.6 最佳柑橘叶点霉属真菌ISSR-PCR体系的建立第110页
            3.2.7 建立的柑橘叶点霉属真菌ISSR-PCR反应体系的稳定性检验第110页
        3.3 ISSR-PCR引物的筛选第110-112页
        3.4 ISSR图谱分析第112-117页
        3.5 ISSR聚类分析第117-119页
    4 结论与讨论第119-121页
第五章 全文总结和有待研究问题第121-124页
参考文献第124-132页
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论文编号ABS4029046,这篇论文共132页
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