猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行腹泻病毒(PEDV)引起的一种临床上以新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水及高死亡率为特征的高度接触性传染病,给全球养猪国家造成了巨大经济损失。目前有关本病的诊断方法多偏重于分子生物学方法,如RT-PCR。虽然RT-PCR方法具有特异、敏感、准确等特点,但该方法成本昂贵、难以应用于大规模临床样品的诊断和流行病学调查。因此,迫切需要建立一种特异、敏感、快速简便诊断PED的方法。本实验应用PCR扩增出PEDV-BS-14毒株的纤突糖蛋白S基因的部分序列,并将其克隆到原核表达载体p GEX-4T-1中,构建出p GEX-4T-1-S表达载体。应用IPTG诱导表达重组S蛋白,并将纯化的重组蛋白以弗氏完全/不完全佐剂乳化后免疫小鼠,制备抗PEDV S蛋白的单克隆抗体。以制备的抗体建立了检测PEDV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并确定、优化了所建立的ELISA反应条件。捕获抗体的最佳包被量为0.6μg,酶标抗体的最佳稀释倍数为1:1000,最佳封闭液为2%BSA,最佳封闭时间为1 h,酶标抗体最佳作用时间为1 h,最佳显色时间为10 min。以建立的双抗体夹心ELISA和RT-PCR方法对PEDV粪便样品进行了比较检测,两者的符合率为100%。应用ELISA检测了吉林省疑似PED流行猪场的粪便样品,发现PEDV阳性检出率为68%。综上所述,本研究成功表达出重组PEDV S蛋白,制备抗PEDV的单克隆抗体,建立了特异、敏感、快速检测PEDV病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省猪群感染PEDV进行了病原流行病学的研究,发现猪群的PEDV阳性感染率为68%,该研究结果将为PEDV诊断及流行病学研究提供技术手段和流行病学理论依据。
