目的:G蛋白偶联受体激酶(GRK)是一类能使G蛋白偶联受体(GPCR)快速脱敏(desensitization)的丝氨酸/苏氨酸激酶家族分子,其基本功能是特异性地磷酸化GPCR,使其快速脱敏与G蛋白解偶联,同时招募β–Arrestin并与之结合,从而阻断GPCR介导的信号转导通路。在哺乳动物中GRK家族共有7个成员,根据结构和功能的相似性分为3个亚家族,GRK4属于GRK4亚家族。在GRK家族中,GRK4的变异率最大,有多个剪接变异体,其组织表达呈高度选择特异性,参与多种疾病的致病机制,如原发性高血压、多巴胺受体介导的神经源性疾病、卵巢癌和乳腺癌等。目前,对于GRK4的了解知之甚少,而关于GRK4在组织器官的分布情况亦缺乏详尽的研究。因此,笔者选取大鼠作为实验动物模型来研究GRK4基因的表达特征及功能,以期为之后的深入研究奠定良好的基础。方法:1.大鼠组织GRK4的表达特征:1)用Trizol提取不同年龄段大鼠卵巢组织和同只大鼠主要组织总RNA,逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR技术从RNA水平检测GRK4的表达特征;2)用加入抑蛋白酶肽、亮抑酶酞、PMSF的RIPA蛋白裂解液提取组织总蛋白,采用Western免疫印迹技术从蛋白水平检测GRK4在不同年龄大鼠各组织中的表达情况。2.GRK4基因及其新剪接变异体的获取和克隆:根据GenBank里大鼠GRK4基因序列设计特异性全长扩增引物;根据Western blot检测结果,用Trizol提取大鼠睾丸和附睾组织总RNA,逆转录合成cDNA,二次PCR扩增出纯度较高的大鼠GRK4基因及其剪接变异体DNA,电泳鉴定;回收电泳琼脂糖凝胶中多个不同分子量的条带,TA克隆,蓝白斑筛选,随机选取阳性克隆经PCR鉴定后,小提质粒送测序;使用NCBI-BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将所得序列与Gen Bank中己有序列进行比对分析,使用NCBI-Spidey工具(http://www.nebi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey)在线分析有效序列各外显子组成及位置。结果:1.大鼠组织GRK4的表达特征:1)通过实时荧光定量PCR技术检测GRK4基因的表达情况,结果显示:(1)大鼠卵巢中GRK4基因的表达水平随卵巢发育成熟而变化;(2)GRK4基因主要表达于大鼠卵巢、肾脏、心和骨骼肌组织。2)通过Western blot检测GRK4蛋白的表达情况,结果显示GRK4在大鼠的胸腺、睾丸、附睾、心和脑组织有较高表达,不同发育阶段其表达情况也不同。2.使用PCR技术扩增出大鼠GRK4基因及其新剪接变异体,TA克隆后送测序,经过比对分析获得2个在GRK4开放阅读框架内的新剪接变异体,命名为GRK4 variant X1和GRK4 variant X2。结论:(1)从时间特异性角度,通过对不同年龄段卵巢组织的研究发现GRK4的表达水平随着卵巢组织的发育程度而变化,提示其与组织生长发育调控有关;从空间特异性角度,GRK4特异性地表达于大鼠睾丸、胸腺、心和脑组织中。(2)克隆获取大鼠睾丸、附睾组织中GRK4的DNA序列,与Genbank中已有序列比对分析后得到两个在GRK4开放阅读框内的新剪接变异体。这些发现为进一步深入研究GRK4的功能提供了很有价值的信息。
