桂枝茯苓胶囊及其单味药茯苓化学成分和生物活性研究

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桂枝茯苓胶囊为我国传统的纯中药制剂,由桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓五味药组成。它有抑制血小板聚集,降低血粘度,缓解子宫痉挛,镇痛等作用,能活血化瘀,缓消症块,用于治疗妇科血瘀症,子宫肌瘤,慢性盆腔炎,卵巢囊肿,痛经等,我们对其粗提物进行了药理活性的筛选,表明具有酪氨酸蛋白激酶抑制作用、C33A宫颈癌细胞生长抑制活性、DPPH抗氧化筛选和血清诱导血管平滑肌细胞增殖抑制活性,并对其活性部位进行了化学成分的研究。作为其中的一味主药,茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核,我国资源丰富,全国各地均有栽培,主产湖北、安徽、云南等省。其性平,味甘、淡,归心、肺、脾、肾经,具有怯湿利水、健脾和胃、宁心安神的作用,多用于治疗小便不利,水肿胀满,痰饮咳逆,脾胃气虚,食少便溏,体倦乏力以及心神不安,惊悸,失眠等症。我们对其粗提物进行了肿瘤坏死因子生产抑制模型和C33A宫颈癌细胞生长抑制活性模型的筛选,发现茯苓乙醇提取物的乙酸乙酯部分和正丁醇部分有一定的活性。本研究运用多种色谱技术和波谱技术,并结合化学方法,主要对茯苓乙醇提取物的乙酸乙酯部分和正丁醇部分以及桂枝茯苓胶囊的正丁醇和水部分进行了系统的化学成分研究。从茯苓中共分离鉴定了41个化合物,分别为pachymic acid (1), eburicoic acid (2), tumulosic acid (3), trametenolic acid (4), dehydropachymic acid (5), dehydrotumulosic acid (6), dehydroeburicoic acid (7), dehydrotrametenolic acid (8),3-epi-dehydropachymic acid (9),3-epi-dehydrotumulosic acid (10), polyporenic acid C (11),6α-hydroxy-polyporenic acid C (12),6α-hydroxy-dehydrotumulosic acid (13),3β-acetyl-16α-hydroxydehydrotrametenolic acid (14), pachymic acid methyl ester (15), palmitic acid (16), oleanic acid (17), carboceric acid (18), ergosta-5,7,22-trien-3β-ol (19), ergosta-6,22-diene-5,8-epidioxy-3-ol (20),3,5-dehydroxyergosta-7,22-dien-6-one (21),3β,5α,9α-trihydroxy-ergosta-7,22-diene-6-one (22), ergosta-7,22-diene-3-one (23),6,9-epoxy-ergosta-7,22-diene-3-ol (24), ergosta-4,22-diene-3-one (25),3β,5α,6β-trihydroxyl-ergosta-7,22-diene (26), ergosta-5,6-epoxy-7,22-dien-3-ol (27), ergosta-4,6,8(14),22-te-traen-3-one (28),β-amyrin acetate (29), α-amyrin acetate (30), daucosterol (31), β-sitosterol (32), adenosine (33), ribitol (34), mannitol (35), oleanic acid3-o-acetate (36), α-D-glucose (37), α-D-Galactose (38), trehalose (39), galactitol (40), histidine (41),其中13为新化合物,化合物21-27,30,32,34-36,39-40为首次从该植物中分离得到;从桂枝茯苓胶囊中分离得到17个化合物,分别是oypaeoniflora (42), caffeic acid (43), mudanpioside F (44), guanosine (45), alanine (46), leucine (47), proline (48),arginine (49),个与茯苓中重复的化合物是5,6,9,10,11,33,37,39,40。对茯苓中分得的部分单体化合物进行了活性筛选,采用MTT法测定了茯苓中分离得到的15个化合物对七种人肿瘤细胞(A549:人肺腺癌细胞;Bel-7402:人肝癌细胞;BGC-823:人胃癌细胞;HCT-8:人结肠癌细胞;A-2780:人卵巢癌细胞;KB:人鼻咽癌细胞;MCF-7:人乳腺癌细胞)的抑制作用。结果显示5个化合物(化合物2,3,4,16,20)对人癌细胞有抑制作用。另外本文还阐述了高效液相色谱法测定桂枝茯苓胶囊中茯苓的4种化合物5,6,9,11的含量。本研究建立了HPLC法同时对桂枝茯苓胶囊中化合物5,6,9,11的含量测定,方法采用C18反相色谱柱,以乙腈-水(0.2%HCOOH)梯度洗脱方法,流速1m1·min-1,在242nm波长处检测4种有效成分的含量。四种成分的线性范围为dehydropachymic acid:0.192-0.96μg; dehydrotumulosic acid:0.408-2.04μg;3-epi-dehydropachymic acid:0.078-0.39μg; polyporenic acid C:0.0756-0.378μg;方法的样品回收率为96.3%,101.0%,98.5%和99.6%,样品的精密度为:1.2%,0.2%,0.2%,0.6%。建立的HPLC法能简便快速的测定桂枝茯苓胶囊中有效成分的含量,为完善该制剂的质量控制方法提供了参考。
摘要第6-8页
Abstract第8-9页
前言第10-12页
第一章 茯苓的化学成分和生物活性研究概况第12-27页
    第一节 茯苓化学成分研究概况第13-25页
    第二节 茯苓生物活性研究概况第25-27页
第二章 桂枝茯苓胶囊及其单味药茯苓化学成分和生物活性研究第27-81页
    第一节 桂枝茯苓胶囊及茯苓化学成分研究结果第27-33页
        一、乙酸乙酯部分化学成分研究结果第27-31页
        二、正丁醇部分化学成分研究结果第31-32页
        三、桂枝茯苓胶囊化学成分研究结果第32-33页
    第二节 新化合物的结构研究第33-36页
    第三节 已知化合物的结构研究第36-66页
        化合物1 pachymic acid的结构鉴定第36页
        化合物2 eburicoic acid的结构鉴定第36-37页
        化合物3 tumulosic acid的结构鉴定第37-38页
        化合物4 trametenolic acid的结构鉴定第38页
        化合物5 dehydropachymic acid的结构鉴定第38-39页
        化合物6 dehydrotumulosic acid的结构鉴定第39-40页
        化合物7 dehydroeburicoic acid的结构鉴定第40-41页
        化合物8 dehydrotrametenolic acid的结构鉴定第41-42页
        化合物9 3-epi-dehydropachymic acid的结构鉴定第42-43页
        化合物10 3-epi-dehydrotumulosic acid的结构鉴定第43-44页
        化合物11 polyporenic acid C的结构鉴定第44-46页
        化合物12 6α-dehydropolyporenic acid C的结构鉴定第46页
        化合物14 3β-acetyl-16α-hydroxy-dehydrotrametenolic acid的结构鉴定第46-47页
        化合物15 pachymic acid methyl ester的结构鉴定第47-48页
        化合物16 palmitic acid的结构鉴定第48页
        化合物17 oleanic acid的结构鉴定第48-50页
        化合物18 carboceric acid的结构鉴定第50页
        化合物19 ergosta-5,7,22-trien-3β-ol的结构鉴定第50页
        化合物20 ergosta-6,22-diene-5α,8α-epidioxy-3-ol)的结构鉴定第50-51页
        化合物21 3β,5α-dihydroxyergosta-7,22-dien-6-one的结构鉴定第51-52页
        化合物22 3β,5α,9α-trihydroxyergosta-7,22-diene-6-one的结构鉴定第52页
        化合物23 ergosta7,22-diene-3-one的结构鉴定第52-53页
        化合物24 6,9-epoxy-ergosta-7,22-diene-3β-ol的结构鉴定第53-54页
        化合物25 ergosta-4,22-diene-3-one的结构鉴定第54页
        化合物26 3β,5α,6β-trihydroxyergosta-7,22-diene的结构鉴定第54-55页
        化合物27 ergosta-5,6-epoxy-7,22-dien-3-ol的结构鉴定第55-56页
        化合物28 ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one的结构鉴定第56页
        化合物29 β-amyrin acetate的结构鉴定第56-57页
        化合物30 α-amyrin acetate的结构鉴定第57页
        化合物31 β-daucosterol)的结构鉴定第57-58页
        化合物32 β-sitosterol的结构鉴定第58-59页
        化合物33 adenosine的结构鉴定第59页
        化合物34 ribitol的结构鉴定第59页
        化合物35 mannitol的结构鉴定第59-60页
        化合物36 oleanic acid 3-acetate的结构鉴定第60页
        化合物37 α-D-glucose的结构鉴定第60页
        化合物38 α-D-galactose的结构鉴定第60-61页
        化合物39 trehalose的结构鉴定第61页
        化合物40 galactitol的结构鉴定第61页
        化合物41 histidine的结构鉴定第61-62页
        化合物42 oypaeoniflora的结构鉴定第62页
        化合物43 caffeic acid的结构鉴定第62-63页
        化合物44 mudanpioside F的结构鉴定第63页
        化合物45 guanosine的结构鉴定第63页
        化合物46 alanine的结构鉴定第63-64页
        化合物47 leucine的结构鉴定第64页
        化合物48 proline的结构鉴定第64页
        化合物49 arginine的结构鉴定第64-66页
    第四节 桂枝茯苓胶囊中4种三萜酸的含量测定第66-71页
        1 桂枝茯苓胶囊HPLC分析方法第66页
            1.1 试剂第66页
            1.2 仪器设备第66页
        2 分析方法第66-68页
            2.1 色谱条件第66-68页
        3 方法学实验第68-70页
            3.1 标准曲线的绘制第68页
            3.2 精密度实验第68页
            3.3 重复性实验第68-69页
            3.4 稳定性实验第69页
            3.5 阴性实验第69页
            3.6 加样回收率实验第69-70页
            3.7 样品测定第70页
        4 讨论第70-71页
            4.1 色谱条件的选择第70页
            4.2 提取溶剂的选择第70页
            4.3 提取方法的选择第70-71页
    第五节 桂枝茯苓胶囊及其单味药茯苓化合物生物活性评价第71-81页
        1 桂枝茯苓胶囊粗提物活性研究第71-75页
            1.1 C33A宫颈癌细胞生长抑制活性模型实验第71-72页
            1.2 酪氨酸蛋白激酶抑制剂筛选第72-73页
            1.3 DPPH抗氧化筛选模型第73-74页
            1.4 血清诱导血管平滑肌细胞增殖抑制活性第74-75页
        2 茯苓粗提物的生物活性研究第75-76页
            2.1 C33A宫颈癌细胞生长抑制活性模型实验结果第75页
            2.2 肿瘤坏死因子生产抑制模型实验(抗炎)第75-76页
            2.3 DPPIV抑制剂筛选模型(降糖)第76页
        3 茯苓单体化合物的生物活性研究第76-81页
            3.1 实验方法第77页
            3.2 茯苓醇提取物单体化合物抗肿瘤活性测定结果第77-81页
第三章 结果与讨论第81-87页
    第一节 茯苓化学成分研究第81-83页
    第二节 茯苓中三萜类化合物的结构问题第83-87页
参考文献第87-93页
第四章 实验部分第93-109页
    第一节 茯苓的植物来源与鉴定第93页
    第二节 实验仪器与试剂第93-94页
    第三节 茯苓的提取与分离流程第94-97页
    第四节 化合物鉴定数据第97-109页
致谢第109-110页
已发表及待发表论文第110-111页
附图第111-119页
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