雷公藤内酯醇对缺氧诱导的视网膜新生血管形成的影响研究

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【目的】探讨雷公藤内酯醇(triptolide,T10)对缺氧诱导的视网膜新生血管形成中的作用。【方法】1、建立人脐静脉内皮细胞的缺氧培养模型,在上清液中加入T10,用MTT检测的方法,确定最佳T10抑制浓度。正常组细胞置于5%的二氧化碳恒温环境中,用RT-PCR和Western blot检测正常组、缺氧组及T10治疗组细胞内VEGF、ANXA2和t-PA的基因及蛋白表达水平。2、新生C57BL/6J小鼠96只随机分为正常组、缺氧组与T10治疗组,每组32只(64眼)。缺氧组与治疗组于生后5天(P5)置于75%氧浓度环境中,P12返回正常空气环境中,治疗组小鼠给予腹腔注射T10,正常组始终置于正常空气环境中。P17对正常组、缺氧组和治疗组行异硫氰酸荧光素灌注造影、视网膜铺片及病理切片,观察视网膜新生血管生成情况;病理切片每只眼选取5张切片,双盲法统计突破内界膜细胞核数;应用Real Time PCR分别检测三组VEGFmRNA、ANXA2mRNA和t-PAmRNA表达水平。【结果】1、T10的最佳抑制浓度为100nmol/L;治疗组与缺氧组相比,降低了人脐静脉细胞中VEGF、t-PA、PAI-1和ANXA2的基因和蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组与正常组无统计学意义(P>0.05)。2、异硫氰酸荧光素灌注视网膜铺片造影正常组小鼠在P17视网膜血管分布均匀,无异常改变。缺氧组小鼠在P17可见视网膜血管明显迂曲、扩张,灌注区与无灌注区交界处发现大量的新生血管丛、微血管瘤及渗出。治疗组小鼠在P17未见视网膜大面积的无灌注区,渗漏及微动脉瘤。视网膜病理切片:对P17小鼠突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核进行计数统计,正常组见到很少突破视网膜内界膜的细胞核数为1.05±0.28/片/眼;缺氧组小鼠中可见大量突破视网膜内界膜的新生血管,细胞核数为81.95±1.93/片/眼,治疗组可见到少量突破视网膜内界膜的新生血管,细胞核数为42.25±1.16/片/眼,缺氧组和治疗组差别具有统计学意义(P<0.05),治疗组和正常组无统计学意义(P>0.05)。3、对正常组、缺氧组和治疗组VEGFmRNA、ANXA2mRNA和t-PAmRNA相对表达水平进行统计学分析,治疗组与缺氧组表达水平差异具有统计学意义(P<0.05),治疗组与正常组的表达水平无统计学意义(P>0.05)。【结论】1、T10对人脐静脉内皮细胞的增殖有抑制作用,可以降低脐静脉内皮细胞中VEGF、ANXA2和t-PA的表达。2、缺氧诱导视网膜新生血管小鼠模型稳定、可靠、重复性高,可做为研究视网膜新生血管疾病发病机制和防治方法的动物模型。3、T10在视网膜新生血管形成中可以抑制VEGF、ANXA2和t-PA的表达。
摘要第7-9页
Abstract第9-10页
英文缩略词表第11-13页
前言第13-15页
第一部分 雷公藤内酯醇(T10)对脐静脉内皮细胞增殖及血管形成相关因子表达的影响第15-35页
    一 实验材料第15-16页
        (一)主要试剂第15页
        (二)实验仪器第15-16页
    二 实验方法第16-25页
        (一)细胞培养第16-17页
        (二)细胞增殖实验第17页
        (三) RT-PCR 检测 HUVEC 细胞 ANXA2mRNA 、VEGFmRNA 和 t-PAmRNA 表达第17-20页
        (四) Western blot 方法检测 HUVEC 细胞 ANXA2 和 VEGF 蛋白的表达第20-24页
        (五)统计学方法第24-25页
    三、实验结果第25-33页
        (一)细胞模型的建立与观察第25-26页
        (二)缺氧状态下的 HUVEC 细胞 VEGFmRNA 表达的变化曲线第26页
        (三)T10 对 HUVEC 细胞抑制的最佳药物浓度第26-27页
        (四) RT-PCR 检测细胞内 VEGF、ANXA2、t-PA 及 PAI-1mRNA 的表达变化第27-33页
    讨论第33-34页
    结论第34-35页
第二部分 雷公藤内酯醇及其衍生物在缺氧诱导小鼠视网膜新生血管形成的作用机制第35-53页
    一. 实验材料第35-37页
        (一)实验装置第35页
        (二)实验动物第35-36页
        (三)主要试剂第36-37页
        (四)实验仪器第37页
    二、实验方法第37-42页
        (一)动物模型的制作第37-38页
        (二)动物分组第38页
        (三)荧光素血管灌注及视网膜铺片第38页
        (四)视网膜组织切片及 HE 染色第38-39页
        (五)实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time PCR)检测小鼠视网膜 t-PA、PAI-1mRNA 表达第39-42页
    三、实验结果第42-50页
        (一)动物模型的建立和病理观察第42-47页
        (二)RT-PCR 检测视网膜组织内 VEGF、ANXA2、t-PA 及PAI-1mRNA 的表达变化第47-50页
    讨论第50-52页
    结论第52-53页
参考文献第53-59页
全文总结第59-60页
综述1第60-67页
    参考文献第64-67页
综述2第67-77页
    参考文献第73-77页
在读期间发表论文和参加科研工作情况第77-78页
致谢第78页
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