目的：1.分离、纯化CD146+血管周围细胞,并进行软骨诱导,探讨其成为软骨修复组织工程的种子细胞可行性；进一步揭示间充质干细胞(MSCs)的血管周围来源。2.研究层流剪切力(laminar shear stress; LSS)对体外培养的大鼠MSCs增殖和凋亡的影响；并初步探讨其抗凋亡机制。3.在体外微重力条件下三维诱导大鼠MSCs向类髓核细胞分化,为退变椎间盘的修复提供种子细胞。方法：1.从大鼠脂肪组织中分离、纯化CD146+血管周围细胞；进行软骨诱导；通过RT-PCR和Western blot检测软骨分化；进一步检测CD146+血管周围细胞的迁移能力。2.大鼠MSCs分组予以生理范围内的层流剪切力力学干预。通过流式细胞学检测细胞周期和凋亡；RT-PCR检测各组细胞的Bcl-2、Bax凋亡相关基因的mRNA表达情况。3.在微重力条件下采用颗粒培养法(pellet culture)诱导骨髓MSCs向髓核细胞分化,建立三个细胞培养组：实验组(0ng/ml TGF-β1和微重力),阳性对照组(10ng/ml TGF-β1和微重力),空白对照组(0ng/ml TGF-β1)。WST-8检测细胞增殖；组织化学和RT-PCR检测细胞分化。结果：1.CD146+血管周围细胞成功从S-D大鼠脂肪组织中分离、纯化培养；流式细胞检测显示：CD146阳性,CD45、CD56、CD34阴性；Sox9和Aggrecan在1mRNA和蛋白水平上均高于对照组；细胞迁移实验显示实验组较高。2.在加载生理力度的LSS (15-dyne/cm2)后,MSCs的DNA合成明显受到抑制；细胞周期检测发现：在细胞加载LSS (15 dyne/cm2)后的不同时间点,处于S和G2/M期的细胞百分含量随着时间变化有明显的下降；细胞凋亡检测显示：,实验组的活细胞比率由59.39%上升到82.37%,24小时保持在81.55%,实验组的凋亡细胞比率由40.61%下降到17.49%,24小时保持在18.83%；生理范围内的力学刺激促进抗凋亡基因的表达,即Bcl-2表达增加,Bcl-2/Bax比率增高。3.诱导培养第三天,TGF-βl对MSCs的增殖有轻度的促进作用；诱导培养第七天,组织染色显示微重力下两组都有胶原和蛋白聚糖存在；蛋白聚糖含量检测实验组显著增高；RT-PCR结果显示微重力条件下软骨细胞标志基因(Sox-9,蛋白聚糖,Ⅱ型胶原)表达量增高；实验组蛋白多糖与胶原的比率(proteoglycans/collagen)是阳性对照组的3.4倍,进一步提示MSC向髓核细胞方向分化。结论：1.成功分离、纯化CD146+血管周围细胞；诱导后CD146+血管周围细胞向软骨细胞方向分化；CD146+血管周围细胞有较好的细胞迁移能力。2.生理范围内的LSS引起MSCs细胞周期抑制和抗凋亡作用,介导MSCs的休眠,这有利于MSCs的干细胞特性保持。3.MSCs在微重力条件下自发向髓核细胞方向分化,证明三维立体培养是诱导MSCs向髓核细胞分化的条件之一,可为椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗提供种子细胞。
