红豆越橘多酚对氧化诱导损伤及癌细胞增殖抑制作用研究
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自由基医学研究表明自由基引发的氧化损伤与人类近百余种疾病密切相关,因此评价和筛选具有强抗氧化活性的天然产物成分已成为医学、生物学和食品科学研究的新趋势。本论文选取红豆越橘为研究对象,采用活性跟踪的方法,获得了活性最强的红豆越橘多酚(LBP),并对其主要成分进行分析鉴定。系统的分析了LBP的体外抗氧化活性,对辐射诱导机体损伤的防护作用及对肿瘤细胞增殖的抑制活性,并对抗氧化活性和抗癌细胞增殖活性进行了相关性分析。结果显示,LBP具有较强的抗氧化和抗癌细胞增殖活性且具有良好的相关性,说明浆果中天然存在的植物化合物的联合作用在抗氧化以及肿瘤预防方面至关重要。采用活性跟踪的方法分离纯化野生红豆越橘,首先用80%丙酮冷冻提取游离型酚类和类黄酮,浓缩后用大孔吸附树脂X-5富集分离红豆越橘多酚,多酚含量和ABTS抗氧化做指标确定乙醇梯度洗脱有效组分,并命名为LB-1,LB-2,LB-3,LB-4,其总洗脱物命名为LB-MIX(LBP)。用MTS法检测以上5个组分抗结肠癌HT29、卵巢癌Hela、肺癌A549和肝癌HepG-2细胞增殖活性,结果显示,LBP具有较好的抑制几株癌细胞的增殖活性。选取抗癌活性较强的顺铂为阳性对照。为了鉴定此纯化物的化学组成,本实验采用UPLC-ESI-MS联用的方法定性分析红豆越橘多酚的组成成分。结果显示,其主要成分有9种花色苷,4种原花青素和5种酚酸。系统的研究了LBP的体外抗氧化活性作用。如清除生理自由基、非生理自由基、还原能力、螯合能力、抗脂质过氧化能力和辐射诱导氧化损伤的防护能力等,结果显示,LBP具有较高的抗氧化活性,并呈良好的剂量效应关系,其氧化能力略低于或与抗氧化剂抗坏血酸相当。并具有较高的金属离子螯合能力和还原能力,对于脂质过氧化和辐射诱导的氧化损伤具有一定的保护。比较了10种浆果与红豆越橘的多酚、黄酮和花色苷含量,不同浆果中多酚、黄酮、花色苷含量差异性显著(p<0.01)。红豆越橘的多酚、黄酮和花色苷含量在11果中排前4位,同时对ABTS+和DPPH的清除活性也居于前列。构建了辐射诱导的氧化损伤模型,实验表明,LBP各剂量组可有效的促进造血和免疫细胞增殖和生长,能够明显的提高小鼠各脏器中超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活性,乳酸脱氢酶(LDH)活性和增加还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,降低髓过氧化物酶(POM)活性,减少丙二醛(MDA)含量,能够有效的激活抗氧化酶系,抑制氧化酶系,减少脂质过氧化,保护细胞膜的损伤,减少微核和染色体畸变率,细胞周期分布显示与模型组比较,LBP加药组使阻滞于G0/G1期的细胞减少而S期和G2/M期细胞增多,呈极显著性差异(p<0.01),细胞增殖能力得到恢复。单细胞凝胶电泳显示辐射前灌胃LBP,可以有效的较少DNA的损伤,使彗星尾长度明显减少。透射电镜再一次证明LBP对脾组织和肠绒毛的保护作用。研究了LBP对癌细胞的增殖抑制活性,结果显示,11种浆果中红豆越橘对HT29和HepG2两种癌细胞的抑制活性最强,蓝靛果对癌细胞的抑制活性较弱,11种浆果对癌细胞的抑制活性与其多酚含量没有显著的相关性。进一步采用琼脂糖凝胶电泳验证了LBP可以使细胞膜损伤产生DNA-Ladder碎片,同时用流式细胞仪对LBP及顺铂作用后的几种癌细胞进行了细胞周期分析,用单细胞凝胶电泳验证了提取物对癌细胞的DNA损伤程度。结果显示,红豆越橘多酚可以从不同角度诱导细胞凋亡。建立了体外抗氧化和抗癌细胞增殖的相关性,揭示了抗氧化剂的抗氧化、清除ROS作用与其防癌抑癌作用之间存在关联,进一步证实了红豆越橘多酚具有较好的功能活性,对于揭示浆果多酚预防由自由基引发的氧化损伤的作用机制以及开发研制新型抗癌药物具有重要的理论和实际意义。
摘要 | 第4-6页 |
Abstract | 第6-7页 |
第1章 绪论 | 第17-41页 |
1.1 研究背景及目的和意义 | 第17-18页 |
1.2 自由基与氧化损伤 | 第18-20页 |
1.3 天然自由基清除剂 | 第20-31页 |
1.3.1 多酚类物质 | 第21-23页 |
1.3.2 黄酮类物质 | 第23-25页 |
1.3.3 花色苷类物质 | 第25-27页 |
1.3.4 花色苷类物质的抗氧化活性 | 第27-30页 |
1.3.5 花色苷类物质的抗肿瘤作用 | 第30页 |
1.3.6 花色苷类物质对视觉的保护作用 | 第30-31页 |
1.3.7 花色苷类物质可有效的减少组织发炎和过敏反应 | 第31页 |
1.4 氧化诱导损伤的产生机制和防御机制 | 第31-39页 |
1.4.1 多酚类化合物抗氧化途径 | 第32-34页 |
1.4.2 多酚类抗辐射作用及修复途径 | 第34-36页 |
1.4.3 多酚类化合物抗肿瘤机制及作用途径 | 第36-38页 |
1.4.4 天然酚类抗氧剂的抗氧化性质与抑癌作用的相关性 | 第38-39页 |
1.5 主要研究内容 | 第39-41页 |
第2章 实验的材料与方法 | 第41-55页 |
2.1 实验材料与仪器设备 | 第41-43页 |
2.1.1 原料 | 第41页 |
2.1.2 细胞及细胞培养基 | 第41页 |
2.1.3 试剂与药品 | 第41-42页 |
2.1.4 仪器与设备 | 第42-43页 |
2.2 红豆越橘多酚的提取纯化鉴定方法 | 第43-44页 |
2.2.1 多酚粗提方法 | 第43页 |
2.2.2 大孔吸附树脂X-5 富集纯化红豆越橘多酚 | 第43页 |
2.2.3 色谱和质谱条件 | 第43-44页 |
2.3 抗氧化活性测定方法 | 第44-46页 |
2.3.1 DPPH法 | 第44页 |
2.3.2 ABTS法 | 第44-45页 |
2.3.3 羟基自由基(· OH)清除能力 | 第45页 |
2.3.4 超氧阴离子自由基(· O~(2-))清除能力 | 第45页 |
2.3.5 总还原力测定 | 第45页 |
2.3.6 铜离子还原能力 | 第45-46页 |
2.3.7 铁离子螯合能力 | 第46页 |
2.3.8 脂质过氧自由基(ROO· ) 清除能力 | 第46页 |
2.4 抗氧化成分测定方法 | 第46-47页 |
2.4.1 多酚含量测定 | 第46-47页 |
2.4.2 类黄酮含量测定 | 第47页 |
2.4.3 花色苷含量测定 | 第47页 |
2.5 动物实验 | 第47-51页 |
2.5.1 辐射诱导氧化损伤实验动物分组 | 第47-48页 |
2.5.2 外周血细胞计数 | 第48页 |
2.5.3 免疫脏器重量的测定 | 第48页 |
2.5.4 小鼠碳廓清指数的测定 | 第48页 |
2.5.5 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖指数 | 第48-49页 |
2.5.6 骨髓细胞微核实验 | 第49页 |
2.5.7 小鼠骨髓细胞染色体畸变实验 | 第49-50页 |
2.5.8 小鼠脾细胞和肠绒毛超微组织形态学观察 | 第50页 |
2.5.9 MDA及氧化还原酶系实验 | 第50-51页 |
2.6 细胞实验 | 第51-54页 |
2.6.1 辐射诱导白细胞氧化损伤的防护 | 第51-52页 |
2.6.2 抗癌细胞增殖活性测定 | 第52页 |
2.6.3 DNA Ladder实验 | 第52-53页 |
2.6.4 流式细胞仪分析细胞周期 | 第53页 |
2.6.5 单细胞凝胶电泳实验方法 | 第53-54页 |
2.7 统计分析方法 | 第54-55页 |
第3章 活性跟踪法确定最优组分并鉴定主要成分 | 第55-67页 |
3.1 引言 | 第55页 |
3.2 大孔树脂富集红豆越橘多酚 | 第55-57页 |
3.3 对癌细胞增殖活性抑制筛选最优组分 | 第57-63页 |
3.3.1 对结肠癌HT29 细胞增殖的影响 | 第57-58页 |
3.3.2 对肝癌HepG2 细胞增殖的影响 | 第58-59页 |
3.3.3 对宫颈癌Hela细胞增殖的影响 | 第59-60页 |
3.3.4 对肺癌A549 细胞增殖的影响 | 第60-62页 |
3.3.5 顺铂对HT29、HepG2 和Hela三种癌细胞的抑制活性 | 第62-63页 |
3.4 红豆越橘多酚(LBP)的主要成分确定 | 第63-65页 |
3.5 本章小结 | 第65-67页 |
第4章 红豆越橘多酚抗氧化活性及抗氧化成分分析 | 第67-81页 |
4.1 红豆越橘多酚清除生理自由基 | 第67-69页 |
4.1.1 清除羟基自由基能力 | 第67-68页 |
4.1.2 清除超氧阴离子自由基 | 第68-69页 |
4.2 红豆越橘多酚还原能力及螯合能力 | 第69-72页 |
4.2.1 总还原能力 | 第69-70页 |
4.2.2 铜离子还原能力 | 第70-71页 |
4.2.3 铁离子螯合能力 | 第71-72页 |
4.3 抗脂质过氧化作用 | 第72-73页 |
4.4 红豆越橘多酚对辐射诱导白细胞损伤的防护效应 | 第73-74页 |
4.5 比较红豆越橘与其他浆果的抗氧化成分和活性 | 第74-80页 |
4.5.1 多酚含量 | 第74-75页 |
4.5.2 黄酮含量 | 第75-76页 |
4.5.3 花色苷含量 | 第76页 |
4.5.4 清除DPPH与ABTS自由基 | 第76-78页 |
4.5.5 总酚、黄酮、花色苷与抗氧化活性相关性分析 | 第78-80页 |
4.6 本章小结 | 第80-81页 |
第5章 红豆越橘多酚对辐射诱导氧化损伤的防护作用 | 第81-110页 |
5.1 引言 | 第81-82页 |
5.2 红豆越橘多酚对体重及其血象的影响 | 第82-85页 |
5.3 LBP对特异性免疫和非特异性免疫的影响 | 第85-87页 |
5.4 红豆越橘多酚对体内相关氧化酶活力的影响 | 第87-94页 |
5.4.1 超氧化物歧化酶(SOD) | 第87-88页 |
5.4.2 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-px) | 第88-89页 |
5.4.3 过氧化氢酶(CAT) | 第89-90页 |
5.4.4 乳酸脱氢酶(LDH) | 第90-91页 |
5.4.5 谷胱甘肽(GSH) | 第91-92页 |
5.4.6 髓过氧化物酶(MPO) | 第92-93页 |
5.4.7 丙二醛 (MDA) | 第93-94页 |
5.5 红豆越橘多酚对骨髓细胞微核数的影响 | 第94-95页 |
5.6 红豆越橘多酚对骨髓染色体畸变的影响 | 第95-96页 |
5.7 红豆越橘多酚对脾细胞周期的影响 | 第96-99页 |
5.8 红豆越橘多酚对小鼠脾细胞DNA损伤的影响 | 第99-102页 |
5.9 小鼠脾细胞和肠绒毛超微组织形态学观察 | 第102-104页 |
5.9.1 小鼠脾组织细胞超微形态学变化 | 第102-104页 |
5.9.2 小鼠肠上皮细胞及微绒毛超微组织形态学变化 | 第104页 |
5.10 相关性分析 | 第104-108页 |
5.10.1 脾组织SOD值与脾淋巴细胞增殖之间的相关性分析 | 第104-105页 |
5.10.2 脾组织SOD值与微核形成数之间的相关性分析 | 第105-107页 |
5.10.3 脾组织LDH值与微核形成数之间的相关性分析 | 第107-108页 |
5.10.4 脾组织MDA值与微核形成数之间的相关性分析 | 第108页 |
5.11 本章小结 | 第108-110页 |
第6章 红豆越橘多酚抗细胞增殖活性研究 | 第110-130页 |
6.1 引言 | 第110-111页 |
6.2 抗癌细胞增殖活性分析 | 第111-113页 |
6.3 多酚类化合物与抗氧化、抗癌细胞增殖相关性分析 | 第113页 |
6.4 倒置显微镜下细胞形态学观察 | 第113-114页 |
6.5 琼脂糖凝胶电泳梯状DNA检测细胞凋亡 | 第114-115页 |
6.6 LBP对肿瘤细胞周期分布的影响 | 第115-119页 |
6.7 LBP对肿瘤细胞DNA损伤的影响 | 第119-121页 |
6.8 LBP抗氧化和抗癌细胞增殖相关性分析 | 第121-126页 |
6.9 LBP抗肝癌细胞增殖和对细胞DNA损伤相关性分析 | 第126-127页 |
6.10 LBP抗肝癌细胞增殖和细胞周期阻滞相关性分析 | 第127-128页 |
6.11 本章小结 | 第128-130页 |
结论 | 第130-132页 |
参考文献 | 第132-147页 |
附录 | 第147-151页 |
攻读学位期间发表的学术论文及其他成果 | 第151-154页 |
致谢 | 第154-155页 |
个人简历 | 第155页 |
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