酿酒酵母Sfil功能性多肽的体外表达与分析

Sfi1蛋白是与酿酒酵母细胞周期密切相关的一种蛋白,其主要功能是维持细胞分裂过程中纺锤体的正确装配,在细胞分裂、细胞形态维持等方面具有重要的作用,但是迄今鲜有文献从分子水平对Sfi1蛋白结构与功能进行系统研究。Sfilp具有21个LLX3F/LX2W模式的内部重复序列,以及20个间隔序列,位于该蛋白的中央区域。Sfilp中央区域的功能主要在于,通过内部重复序列结合酵母中心体蛋白Cdc31p,从而作用于SPB的复制过程。然而,Sfilp的氨基端与羧基端区域虽不含有内部重复序列,但是生物信息学分析发现,Sfilp的羧基端存在七个,氨基端存在两个可能的细胞周期蛋白依赖激酶Cdc28的保守磷酸化位点；同时酵母细胞水平发现,将其缺失会导致细胞分裂出现异常,在调控SPB的复制功能上起关键性作用。因此对Sfi1蛋白的深入研究,本课题重点是从其功能性多肽的研究角度来切入,其中包括对内部保守多肽和两端的磷酸化多肽的分析。本论文从两个方面来阐述对酿酒酵母Sfilp功能性多肽的研究,一方面通过对其内部21个保守多肽的同源分析,发现第20个保守多肽具有研究代表性,我们针对此段多肽构建肽库,其中包括野生型,定点突变型以及随机突变型Sfi1多肽,来研究突变对Sfi1多肽与中心体蛋白Cdc31p相互作用的影响,以及对Sfilp生物学功能的影响；一方面针对Sfilp氨基端和羧基端的磷酸化多肽进行体外表达,为后期的体外磷酸化研究奠定基础。本实验通过计算机同源模建来比对位于第20个保守多肽上的定点突变型Sfi1多肽,即Sfi1p-763的三维构象,将此位置的氨基酸进行随机突变,发现L763H的末端构象稍有差异,a-螺旋较为舒展,然后利用常规PCR技术及融合PCR技术,分别扩增得到SFIl野生型及定点突变型的基因序列,再利用酵母表面展示技术,在酵母细胞中诱导表达Sfi1多肽,发现其诱导表达的最佳条件为诱导温度20℃,乳糖浓度0.02g/ml,诱导时间24h。通过SDS-PAGE检测,发现Sfi1p定点突变L763H并没有影响Sfi1多肽与Cdc31p的相互作用。而通过流式细胞检测DNA含量发现,L763H使细胞周期停滞在G2/M期,并且影响酵母细胞的生长状态。本实验还采用错误倾向PCR技术,扩增得到Sfi1多肽的编码基因库；将编码基因克隆至表面展示载体,获得Sfi1多肽表达载体库；将表达载体库转化酵母细胞,诱导表达多肽,获得Sfi1多肽肽库,并通过SDS-PAGE检测Sfi1随机突变多肽与Cdc31p的相互作用。此外,通过常规PCR技术扩增得到sFIl-N端和C端基因序列,构建至蛋白表达载体pET上,在大肠杆菌BL21细胞中,使用诱导剂IPTG对Sfilp-N端和C端多肽进行体外诱导表达,其中Sfilp-N端多肽诱导表达的最佳条件是：诱导温度为25℃,IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为4h:Sfilp-C端多肽诱导表达的最佳条件是诱导温度为30℃,IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为8h.Sfilp-N端和C端磷酸化多肽成功地体外表达,为研究Sfilp-N端和C端的磷酸化机制奠定了基础。