靶标代谢组学与实时荧光定量PCR分析技术在疾病研究中的应用
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冠心病是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一,本文以系统生物学的研究理念为指导,采用转录组学技术(基因芯片技术和RT-PCR技术)对冠心病临床预诊断的关键候选基因进行了筛选和定量研究,并采用代谢组学方法对冠心病治疗药物的疗效进行了评价研究。选取血脂差异冠心病为研究对象,针对前期研究得到的高脂冠心病和非高脂冠心病的基因表达谱数据,进行了进一步分析,首先得到差异表达基因和相关通路,并采用RT-PCR分析技术对临床样本中的6个脂代谢相关基因进行了验证,最后利用生物信息学和化学计量学分析方法确定其中的ACSL1和ADIPOQ基因可能可以作为冠心病预诊断的关键候选基因,可望为冠心病特别是极易漏诊的非高脂冠心病的临床筛查提供新的检查指标。将靶标代谢组学分析技术应用于新药D-4F治疗冠心病疗效评价的研究中,根据前期D-4F治疗冠心病疗效评价的代谢组学研究鉴定的潜在生物标志物,重点关注磷脂代谢循环,并采用正相HPLC-TOF/MS技术对其中的12种差异显著的磷脂代谢相关化合物进行定量分析,结果显示其中的4种溶血卵磷脂类化合物(LPC(18:3),LPC(20:2),LPC(20:3)和LPC(20:4))和1种甘油二酯类化合物(DG(22:5/15:0/0:0))可能可以作为D-4F治疗冠心病疗效评价的潜在标志物。提示降低血液中的磷脂尤其是长链溶血卵磷脂类化合物(LysoPC(C≥16))的浓度可能是D-4F治疗冠心病的主要原因,从而提示我们降低冠心病患者体内的长链LysoPC含量可能是有效治疗冠心病的措施之一。采用UPLC-TOF/MS初步建立了一种8min内同时快速定量分析24种嘌呤嘧啶和牛磺酸代谢产物的分析方法,为进行嘌呤嘧啶和牛磺酸代谢紊乱相关疾病的靶标代谢组学研究提供了基础。
摘要 | 第5-6页 |
Abstract | 第6页 |
第一章 前言 | 第10-21页 |
1.1 代谢组学分析技术 | 第10-11页 |
1.1.1 代谢组学的三个研究层次 | 第10页 |
1.1.2 代谢物靶标分析 | 第10-11页 |
1.2 实时荧光定量RT-PCR分析技术 | 第11-15页 |
1.2.1 RT-PCR技术简介 | 第11-12页 |
1.2.2 RT-PCR的化学原理 | 第12-13页 |
1.2.3 RT-PCR的扩增曲线 | 第13-14页 |
1.2.4 RT-PCR标准曲线 | 第14-15页 |
1.3 冠心病的发病机制 | 第15-18页 |
1.3.1 损伤反应(包括炎症)学说 | 第15-16页 |
1.3.2 冠心病相关代谢 | 第16-18页 |
1.4 嘌呤嘧啶与牛磺酸代谢 | 第18-19页 |
1.5 本课题的主要研究内容 | 第19-21页 |
第2章 RT-PCR技术对血脂差异冠心病临床样本靶标基因验证研究 | 第21-46页 |
2.1 研究背景 | 第21页 |
2.2 通路分析和候选基因的选择 | 第21-28页 |
2.2.1 H-CHD,NH-CHD与正常人差异通路分析 | 第22-27页 |
2.2.2 RT-PCR验证基因筛选 | 第27-28页 |
2.3 临床样本信息 | 第28-29页 |
2.4 RT-PCR分析方法的建立 | 第29-36页 |
2.4.1 实验仪器和试剂 | 第29页 |
2.4.2 引物设计 | 第29-30页 |
2.4.3 Total RNA提取和cDNA的合成 | 第30-31页 |
2.4.4 制备精致产物 | 第31页 |
2.4.5 OD值和cDNA浓度的测定 | 第31-32页 |
2.4.6 标准曲线的建立 | 第32页 |
2.4.7 96孔板样本分析 | 第32-36页 |
2.5 数据处理 | 第36-44页 |
2.5.1 组间t检验和协方差分析 | 第36-38页 |
2.5.2 受试者工作曲线(ROC)分析 | 第38-43页 |
2.5.3 不同目标基因的PLS-DA聚类比较 | 第43-44页 |
2.6 重点目标基因的生物学意义解释 | 第44-45页 |
2.7 本章小结 | 第45-46页 |
第3章 HPLC-TOF/MS对冠心病药物疗效评价的磷脂代谢定量研究 | 第46-62页 |
3.1 定量代谢物的选择 | 第46-48页 |
3.2 实验部分 | 第48-56页 |
3.2.1 实验试剂、仪器与样本信息 | 第48-49页 |
3.2.2 分析方法建立 | 第49-55页 |
3.2.3 HPLC-TOF/MS样本分析 | 第55-56页 |
3.3 数据处理 | 第56-61页 |
3.3.1 组间t检验和协方差分析 | 第56-58页 |
3.3.2 PLS-DA和PCA分析 | 第58-59页 |
3.3.3 差异代谢物的生物学意义解释 | 第59-61页 |
3.4 本章小结 | 第61-62页 |
第4章 嘌呤嘧啶和牛黄酸循环代谢物UPLC-TOF/MS分析方法 | 第62-72页 |
4.1 研究背景 | 第62页 |
4.2 实验试剂与仪器 | 第62-63页 |
4.3 标准溶液的配制 | 第63-65页 |
4.4 分析方法的优化 | 第65-70页 |
4.5 分析方法应用展望 | 第70-72页 |
结论 | 第72-74页 |
参考文献 | 第74-83页 |
致谢 | 第83-84页 |
附录:本人硕士期间已发表和待发表的论文 | 第84-85页 |
卷内备考表 | 第85页 |
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