靶标代谢组学与实时荧光定量PCR分析技术在疾病研究中的应用

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冠心病是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一,本文以系统生物学的研究理念为指导,采用转录组学技术(基因芯片技术和RT-PCR技术)对冠心病临床预诊断的关键候选基因进行了筛选和定量研究,并采用代谢组学方法对冠心病治疗药物的疗效进行了评价研究。选取血脂差异冠心病为研究对象,针对前期研究得到的高脂冠心病和非高脂冠心病的基因表达谱数据,进行了进一步分析,首先得到差异表达基因和相关通路,并采用RT-PCR分析技术对临床样本中的6个脂代谢相关基因进行了验证,最后利用生物信息学和化学计量学分析方法确定其中的ACSL1和ADIPOQ基因可能可以作为冠心病预诊断的关键候选基因,可望为冠心病特别是极易漏诊的非高脂冠心病的临床筛查提供新的检查指标。将靶标代谢组学分析技术应用于新药D-4F治疗冠心病疗效评价的研究中,根据前期D-4F治疗冠心病疗效评价的代谢组学研究鉴定的潜在生物标志物,重点关注磷脂代谢循环,并采用正相HPLC-TOF/MS技术对其中的12种差异显著的磷脂代谢相关化合物进行定量分析,结果显示其中的4种溶血卵磷脂类化合物(LPC(18:3),LPC(20:2),LPC(20:3)和LPC(20:4))和1种甘油二酯类化合物(DG(22:5/15:0/0:0))可能可以作为D-4F治疗冠心病疗效评价的潜在标志物。提示降低血液中的磷脂尤其是长链溶血卵磷脂类化合物(LysoPC(C≥16))的浓度可能是D-4F治疗冠心病的主要原因,从而提示我们降低冠心病患者体内的长链LysoPC含量可能是有效治疗冠心病的措施之一。采用UPLC-TOF/MS初步建立了一种8min内同时快速定量分析24种嘌呤嘧啶和牛磺酸代谢产物的分析方法,为进行嘌呤嘧啶和牛磺酸代谢紊乱相关疾病的靶标代谢组学研究提供了基础。
摘要第5-6页
Abstract第6页
第一章 前言第10-21页
    1.1 代谢组学分析技术第10-11页
        1.1.1 代谢组学的三个研究层次第10页
        1.1.2 代谢物靶标分析第10-11页
    1.2 实时荧光定量RT-PCR分析技术第11-15页
        1.2.1 RT-PCR技术简介第11-12页
        1.2.2 RT-PCR的化学原理第12-13页
        1.2.3 RT-PCR的扩增曲线第13-14页
        1.2.4 RT-PCR标准曲线第14-15页
    1.3 冠心病的发病机制第15-18页
        1.3.1 损伤反应(包括炎症)学说第15-16页
        1.3.2 冠心病相关代谢第16-18页
    1.4 嘌呤嘧啶与牛磺酸代谢第18-19页
    1.5 本课题的主要研究内容第19-21页
第2章 RT-PCR技术对血脂差异冠心病临床样本靶标基因验证研究第21-46页
    2.1 研究背景第21页
    2.2 通路分析和候选基因的选择第21-28页
        2.2.1 H-CHD,NH-CHD与正常人差异通路分析第22-27页
        2.2.2 RT-PCR验证基因筛选第27-28页
    2.3 临床样本信息第28-29页
    2.4 RT-PCR分析方法的建立第29-36页
        2.4.1 实验仪器和试剂第29页
        2.4.2 引物设计第29-30页
        2.4.3 Total RNA提取和cDNA的合成第30-31页
        2.4.4 制备精致产物第31页
        2.4.5 OD值和cDNA浓度的测定第31-32页
        2.4.6 标准曲线的建立第32页
        2.4.7 96孔板样本分析第32-36页
    2.5 数据处理第36-44页
        2.5.1 组间t检验和协方差分析第36-38页
        2.5.2 受试者工作曲线(ROC)分析第38-43页
        2.5.3 不同目标基因的PLS-DA聚类比较第43-44页
    2.6 重点目标基因的生物学意义解释第44-45页
    2.7 本章小结第45-46页
第3章 HPLC-TOF/MS对冠心病药物疗效评价的磷脂代谢定量研究第46-62页
    3.1 定量代谢物的选择第46-48页
    3.2 实验部分第48-56页
        3.2.1 实验试剂、仪器与样本信息第48-49页
        3.2.2 分析方法建立第49-55页
        3.2.3 HPLC-TOF/MS样本分析第55-56页
    3.3 数据处理第56-61页
        3.3.1 组间t检验和协方差分析第56-58页
        3.3.2 PLS-DA和PCA分析第58-59页
        3.3.3 差异代谢物的生物学意义解释第59-61页
    3.4 本章小结第61-62页
第4章 嘌呤嘧啶和牛黄酸循环代谢物UPLC-TOF/MS分析方法第62-72页
    4.1 研究背景第62页
    4.2 实验试剂与仪器第62-63页
    4.3 标准溶液的配制第63-65页
    4.4 分析方法的优化第65-70页
    4.5 分析方法应用展望第70-72页
结论第72-74页
参考文献第74-83页
致谢第83-84页
附录:本人硕士期间已发表和待发表的论文第84-85页
卷内备考表第85页
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