海参脑苷脂对阿尔茨海默症模型小鼠脑组织相关鞘脂的影响分析

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海参脑苷脂(SCC)是一类结构独特的鞘脂类化合物,具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌、心血管保护等作用。目前,其神经保护作用引起关注,并有望开发成为改善老年性脑功能衰退的药物。阿尔茨海默症(Alzheimer‘s disease,AD)是一种原发性退行性疾病,发病原因及机理复杂,发病率逐年增加,已成为不可忽视的社会问题。已有研究表明,鞘脂代谢的异常与AD密切相关。本论文主要利用LC-MS/MS技术,研究SCC对AD小鼠脑组织相关鞘脂含量及分子种的影响,从鞘脂组学方面探究SCC对AD的改善作用。建立了小鼠脑组织中主要鞘脂含量测定的简便准确的正相液相色谱-质谱联用方法(NPLC-MS/MS)。以Agilent RX-SIL柱(2.1mm×100mm,1.8μm)为分离柱,氯仿/甲醇/氨水(89.5/10/0.5,v/v)、氯仿/甲醇/水/氨水(55/39/5/0.5,v/v)为流动相,实现了脑苷脂、神经酰胺、硫苷脂、鞘磷脂等4类鞘脂的分离和定量。采用该方法,对正常组、模型组、实验组的鼠脑的海马及皮质的上述鞘脂进行分析。结果表明,模型组相对正常组,其海马和皮质的脑苷脂含量分别下降23.96%和24.23%,神经酰胺含量分别升高67.96%和10.15%,硫苷脂含量分别下降54.82%和23.39%,鞘磷脂含量无明显变化。实验组相对模型组,海马中脑苷脂含量有上升趋势,神经酰胺含量下降32.79%,硫苷脂含量上升45.38%,鞘磷脂无显著性差异。建立了小鼠脑组织中脑苷脂、神经酰胺、硫苷脂分子种分析的反相色谱-质谱联用方法(RPLC-MS/MS)。以Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1mm×50mm,1.8μm)为分离柱,以甲醇/水(97/3,v/v,含0.5%甲酸和5mmol/L甲酸)为流动相,实现了对脑苷脂和神经酰胺分子种的分析,以甲醇/异丙醇/水(85/10/5,v/v,含0.5%甲酸和5mmol/L甲酸)为流动相实现了对硫苷脂分子种的分析。对于脑苷脂、神经酰胺、硫苷脂的定性,除采用质谱子离子扫描和母离子扫描模式外,利用分子种在色谱柱上的保留时间对其结构进行鉴定,大大提高了各分子种结构分析的效率。另外,采用MRM模式,对正常组、模型组、实验组的脑苷脂、硫苷脂、神经酰胺分子种定量,筛选出潜在的鞘脂标志物:羟基化脂肪酸型脑苷脂/非羟基化脂肪酸型脑苷脂(HFA-GalCer/NFA-GalCer)、神经酰胺d18:1-C18:0、硫苷脂d18:1-C24:1、羟基化脂肪酸型硫苷脂/非羟基化脂肪酸型硫苷脂(HFA-Sulf/NFA-Sulf)、超长链脂肪酸型硫苷脂/长链脂肪酸型硫苷脂(VLFA-Sulf/LFA-Sulf)。模型组相对正常组,海马及皮质的HFA-GalCer/NFA-GalCer分别升高25.13%和14.36%,Cer-d18:1-C18:0分别升高30.63%和10.49%, Sulf-d18:1-C24:1分别降低43.31%和30.26%,HFA-Sulf/NFA-Sulf分别降低34.16%和26.34%,VLFA-Sulf/LFA-Sulf分别降低38.08%和18.33%;实验组相对模型组,海马的各指标变化较明显,其HFA-GalCer/NFA-GalCer降低12.24%, Cer-d18:1-C18:0降低11.81%,Sulf-d18:1-C24:1升高19.39%, HFA-Sulf/NFA-Sulf升高26.34%,VLFA-Sulf/LFA-Sulf升高22.44%。而皮质的各指标基本无显著变化,只有VLFA-Sulf/FA-Sulf升高15.30%。另外对3组样品中的鞘脂分子种进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),发现正常组、模型组、实验组的鼠脑海马中脑苷脂和硫苷脂分子种均可明显区分。建立了小鼠脑组织中葡萄糖脑苷脂定性定量分析的亲水液相色谱-质谱联用方法(HILIC LC-MS/MS)。以WatersAtlantis HILIC Silica(4.6mm×150mm,5μm)为分离柱,乙腈/甲醇/水(95/2.5/2.5,v/v,含2%甲酸和2mmol/L甲酸铵)为流动相,在8min内实现了葡萄糖脑苷脂的分析。采用MRM模式,对3组小鼠的海马及皮质组织中葡萄糖脑苷脂分析,发现模型组小鼠海马及皮质中的葡萄糖脑苷脂d18:1-C18:0相对正常组小鼠分别提高45.05%和30.41%,半乳糖脑苷脂/葡萄糖脑苷脂(GalCer/GlcCer)的比例分别降低50.68%和21.08%,但实验组相对模型组无显著性差异。
摘要第5-7页
Abstract第7-9页
0 前言第12-26页
    0.1 海参脑苷脂第12-15页
        0.1.1 海参概述第12页
        0.1.2 脑苷脂来源及基本结构第12-13页
        0.1.3 哺乳动物及海参中的脑苷脂分子种特点第13-14页
        0.1.4 脑苷脂生物活性及应用第14-15页
    0.2 鞘脂概述第15-21页
        0.2.1 鞘脂结构与分类第15-16页
        0.2.2 鞘脂组学第16-17页
        0.2.3 鞘脂代谢第17-18页
        0.2.4 生物样本中鞘脂的提取纯化及定性定量研究第18-21页
    0.3 阿尔茨海默症第21-25页
        0.3.1 阿尔茨海默症概述第21-23页
        0.3.2 阿尔茨海默症鞘脂代谢特点第23-25页
    0.4 本研究的目的与意义第25-26页
1 海参脑苷脂对 AD 模型小鼠脑组织鞘脂含量的影响分析第26-43页
    1.1 材料与仪器第26-27页
        1.1.1 材料与试剂第26-27页
        1.1.2 设备及仪器第27页
    1.2 实验方法第27-32页
        1.2.1 海参脑苷脂的提取纯化及纯度检测第27-28页
        1.2.2 动物实验第28-29页
        1.2.3 鼠脑组织海马及皮质的获取第29页
        1.2.4 小鼠脑组织鞘脂的提取第29-30页
        1.2.5 NPLC-MS/MS 法检测小鼠脑组织鞘脂的含量第30-32页
    1.3 结果与讨论第32-42页
        1.3.1 海参脑苷脂的提取及纯度测定第32页
        1.3.2 鼠脑组织鞘脂的提取第32-33页
        1.3.3 鞘脂含量分析方法的优化第33-36页
        1.3.4 NPLC-MS/MS 方法学考察结果第36-37页
        1.3.5 鞘脂母离子的筛选第37-39页
        1.3.6 海参脑苷脂对 AD 小鼠脑组织主要鞘脂含量的影响第39-42页
    1.4 本章小结第42-43页
2 海参脑苷脂对 AD 模型小鼠脑组织主要鞘脂分子种的影响分析第43-69页
    2.1 材料与仪器第43-44页
        2.1.1 材料与试剂第43-44页
        2.1.2 设备及仪器第44页
    2.2 实验方法第44-45页
        2.2.1 标准溶液配制第44页
        2.2.2 样品处理及 RPLC-MS/MS 条件第44页
        2.2.3 方法学考察第44-45页
        2.2.4 数据处理第45页
    2.3 结果与讨论第45-68页
        2.3.1 色谱及质谱条件的优化第45-47页
        2.3.2 小鼠脑组织中主要鞘脂分子种的筛选第47-55页
        2.3.3 RPLC-MS/MS 方法学考察结果第55页
        2.3.4 海参脑苷脂对 AD 小鼠脑组织主要鞘脂分子种的影响第55-68页
    2.4 本章小结第68-69页
3 海参脑苷脂对 AD 模型小鼠脑组织葡萄糖脑苷脂的影响分析第69-78页
    3.1 材料与仪器第69-70页
        3.1.1 材料与试剂第69-70页
        3.1.2 设备及仪器第70页
    3.2 实验方法第70-71页
        3.2.1 标准溶液的配制第70页
        3.2.2 样品前处理方法第70页
        3.2.3 色谱及质谱条件第70-71页
        3.2.4 方法学考察第71页
    3.3 结果与讨论第71-76页
        3.3.1 色谱及质谱条件的确定第71-72页
        3.3.2 样品溶剂的选择第72页
        3.3.3 葡萄糖脑苷脂的定性分析第72-73页
        3.3.4 HILIC LC-MS/MS 方法学考察结果第73-74页
        3.3.5 海参脑苷脂对 AD 小鼠脑组织葡萄糖脑苷脂的影响第74-76页
    3.4 本章小结第76-78页
4 结论第78-80页
    4.1 总结第78-79页
    4.2 本论文创新点第79-80页
5 参考文献第80-89页
6 致谢第89-90页
个人简历第90页
发表的学术论文第90-91页
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