树鼩和人载脂蛋白A5基因的克隆表达和载脂蛋白A5以及载脂蛋白C3基因多态性研究--1. 不易感动脉粥样硬化动物—树鼩和人载脂蛋白A5基因的克隆、表达和结构分析 2. 中国汉族人群载脂蛋白A5和载脂蛋白C3基因多态性与血浆脂质的关系

载脂蛋白A5（有多种拼写形式如Apolipoprotein A5，Apolipoprotein AV，Apolipoprotein A-V，APOA5，APOAV，APOA-V或者RAP3，本文把载脂蛋白A5统一简写为APOA5）是首先在人体内被发现的一个编码载脂蛋白的新基因，与血浆甘油三酯的关系极为密切。为了系统研究树鼩不易感动脉粥样硬化的机制，本课题组已经成功克隆了多个与脂蛋白代谢相关的基因，如APOAI，APOCI，APOE，APOCII，LPL，ABCA1，PLTP，LACT和CETP等。为全面了解各种载脂蛋白的结构和功能，我们把分离、克隆树鼩APOA5基因cDNA全长以及表达树鼩APOA5基因作为本论文的研究目标。 树鼩肝组织总RNA使用Trizol试剂提取，经过PolyATractTM mRNA磁珠分离纯化系统得到了高纯度的mRNA，进一步逆转录合成cDNA第一链。通过比较人、大鼠、小鼠APOA5基因cDNA的核苷酸序列，在高度保守区设计引物进行PCR扩增。目的条带经过内侧引物PCR鉴定后克隆进入T-easy载体，转化大肠杆菌DH5α后涂在有氨苄青霉素抗性的平板上，挑选鉴定阳性克隆以后进行序列测定。将序列结果进一步与人、大鼠、小鼠APOA5基因的核苷酸序列进行同源性分析以确定是否为目的序列。通过上述方法得到尽可能长的cDNA序列，以利以后的实验。 在已经获得的cDNA序列中设计5’和3’快速扩增cDNA末端引物，利用RACE试剂盒得到5’和3’端完整的cDNA第一链，并以之为模板根据SMARTTM RACE试剂盒的说明书扩增APOA5基因cDNA的5’和3’末端，最后经过拼接得到完整的APOA5基因cDNA第一链。树鼩APOA5基因有两个转录本，一个为1948个碱基，另一个为1937个碱基，推测这是由于poly（A）尾的选择性剪接造成的，它们预测的开放阅读框是完全相同的，即1110个碱基，推测该基因编码369个氨基酸，在N—末端含有一个长23个氨基酸的信号肽。预测树鼩与人、大鼠、小鼠APOA5基因编码的氨基酸同源性分别为81.0％、68.7％和66.7％。在此基础上，再设计上游引物