目的:应用生物学信息方法预测可能作用于YB-1 3’UTR的microRNA,并构建其过表达载体,靶向干扰YB-1基因的表达,观察其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及侵袭转移等恶性生物学行为的影响,探讨microRNA在肿瘤细胞中的作用及作用机制,为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据。方法:采用microRNA靶基因预测软件预测可能作用于YB-1基因的microRNA,构建其过表达载体;利用脂质体Lipofectamine 2000转染入细胞MDA-MB-231细胞,荧光显微镜下评估转染效果, real-time PCR检测microRNA的过表达,RT-PCR、real-time PCR和Western blot检测YB-1 mRNA和蛋白的表达,双荧光素酶法确定microRNA的作用位点。选择抑制效果最好的microRNA,G418筛选其单克隆细胞株。MTT法检测细胞体外增殖能力的改变;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平变化;Transwell实验、MMP2与MMP9基因表达的检测判断肿瘤细胞侵袭能力。结果:利用microRNA靶基因预测软件,综合各软件预测结果,选取microRNA216、microRNA137和microRNA153三个microRNA,设计并构建了三组重组干扰载体pGenesil1-premiR-YB-1,酶切、测序结果表明载体构建成功, real-time PCR结果表明pGensil1-pre-microRNA实验组细胞较对照组microRNA表达明显增高(P<0.05);RT-PCR、real-time PCR与Western blot结果显示pGenesil1-premiR137-YB-1抑制效果最好, G418成功筛选MDA-MB231/premiR137-YB-1单克隆细胞株,并以之作为实验组进行后续实验。双荧光素酶分析显示共转染microRNA137表达载体与荧光报告载体后,荧光素酶活性较对照组降低30%。MTT结果表明MDA-MB231/premiR137-YB-1实验组细胞体外增殖能力下降(P<0.05);与对照组相比,pGensil1-pre-mir137实验组细胞中G1期细胞比例明显增高(P<0.05),S期细胞比例明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05);同时,实验组细胞侵袭能力有所降低(P<0.05);与两对照组相比,MMP2、MMP9基因mRNA和蛋白水平表达均降低(P<0.05)。结论:靶向YB-1基因的microRNA表达载体构建成功,成功筛选出过表达microRNA137的MDA-MB231/premiR137-YB-1单克隆细胞株,microRNA137可通过靶向YB-1的3’非编码区,下调MDA-MB231细胞YB-1基因的表达,促使MDA-MB231细胞周期阻滞于G1期,S期的细胞数量减少,而抑制细胞体外增殖、促进细胞凋亡发生;下调MMP-2、MMP-9基因表达,抑制细胞侵袭转移能力。
