第一部分 以莽草酸脱氢酶为靶点的抗结核药物筛选研究 第二部分 靶向结核分枝杆菌耐酸机制药物筛选模型的前期研究

本论文包括两部分的工作：第一部分莽草酸脱氢酶(Shikimate dehydrogenase, SD)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)的生长繁殖密切相关,被认为是潜在的抗结核药物新靶标。获得具有抗结核活性的结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶(MtSD)抑制剂,对于该靶标的验证具有重要意义。本论文在克隆表达MtSD的基础上,采用反复冻融和Ni2+亲和层析的方法,纯化得到了高纯度的MtSD；并验证了所得到的MtSD具有天然SD酶活性；优化了酶活测定体系,构建了以MtSD为靶点的高通量抗结核药物筛选模型；应用此模型对5万个化合物进行了筛选,得到11个具有抑制MtSD活性的化合物,筛选阳性率为0.022%；对MtSD抑制剂进行抗菌活性测定,从中发现10个有抗结核活性的化合物,其中7957118的MIC为05μg kg-1本论文为高通量筛选MtSD抑制剂提供了切实可行的方法。采用分子对接方法对筛到的具有抗结核活性的化合物与MtSD蛋白的相互作用方式进行评价,发现抗结核活性较好的化合物7957118与MtSD对接分值较高,通过酶动力学研究,阐明化合物7957118为MtSD的非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为70.55μM。通过MTS法评价了9个抗结核活性化合物对小鼠巨噬细胞J774A.1的毒性,发现3个化合物细胞毒性较低,其中7957118酶抑制活性高且细胞毒性低,有可能成为作用于MtSD的新型抗结核先导化合物,同时为验证MtSD可以作为抗结核药物新靶标提供了探针分子。第二部分结核杆菌的耐酸能力与其在宿主体内的长期存在密切相关,从破坏其耐酸能力入手有可能获得全新作用方式的抗结核药物。本论文通过比较分枝杆菌的抗酸性,确定了耻垢杆菌可以作为模式菌,进行靶向结核杆菌耐酸机制的药物研究；利用同源重组的方法敲除了耻垢杆菌中Rv3671c的同源基因MSMEG6183,得到了该基因的突变体,该突变体的菌体形态发生改变且耐酸性下降。已经获得的实验结果为进一步开展相关研究奠定了基础。