花生四烯酸5-脂氧酶调节脑外伤和神经突起生长的作用

5-脂氧酶（EC1.13.11.34，5-lipoxygenase，5-LOX）是机体催化花生四烯酸（arachidonic acid）生成白三烯类生物活性物质的限速酶。5-LOX在静息状态下，分布于细胞浆和细胞核内，受到病理因素刺激后，转位到细胞核膜代谢花生四烯酸生成产物白三烯（leukotrienes，LTs）。近年来，5-LOX的分子生物学与细胞生物学研究取得了较大进展，提示5-LOX也可能作为一种细胞内结构蛋白起着非酶作用。研究表明，5-LOX在中枢神经系统有广泛分布，并参与了许多神经生理与病理过程。脑外伤是成年人致死和致残的重要原因。脑外伤为代表的脑损伤能够导致一系列的损伤反应，这些反应可分为早期和后期（慢性）损伤反应。在损伤早期，主要的病理生理变化包括兴奋性毒性，氧化应激，自由基产生，细胞凋亡，炎症反应和变性。在损伤后期，主要的病理生理变化包括血管增生、神经元再生、神经环路重建、反应性神经胶质增生以及神经胶质疤痕形成（主要由增生的星形胶质细胞组成）。有些后期变化（如血管增生，神经元再生和神经环路重建）有利于神经功能恢复；有些变化（如反应性神经胶质增生以及胶质疤痕）不利于恢复。本论文旨在研究：（1）人脑外伤和星形胶质瘤样本中，5-LOX表达特点；（2）脑外伤动物模型（小鼠脑冷冻伤）中，5-LOX表达特点；（3）5-LOX抑制剂咖啡酸对小鼠脑冷冻伤的保护作用特点，尤其对损伤后期脑重构的星形胶质细胞增生和胶质疤痕的作用特点；（4）5-LOX对NGF诱导后PC12细胞神经突起生长的影响，探讨5-LOX参与脑损伤后神经环路重建的作用。从以上几个方面，阐明5-LOX在不同病理条件下的调节作用，以及作为神经保护作用新的靶点的可能性。第一部分人脑外伤和星形胶质细胞瘤的5-脂氧酶表达特点脑损伤和脑肿瘤的脑组织中，5-LOX代谢产物白三烯的含量升高；有文献报道，5-LOX在脑中广泛分布，且5-LOX抑制剂具有神经保护作用。然而，在人脑外伤以及脑星形胶质细胞瘤中的5-LOX的表达特点，仍未得到研究。本研究采用免疫组织化学方法研究在上述疾病中5-LOX脑内表达特点。本研究发现，在人脑相对正常的组织中，5-LOX表达在神经元以及胶质细胞上；未发现表达在脑微血管内皮细胞上。神经元中5-LOX有两种表达模式：在细胞核和细胞浆内；只在细胞浆内。在人脑外伤标本中，5-LOX在胶质细胞和中性粒细胞中表达增加；双标免疫组织化学实验，发现5-LOX表达在部分GFAP阳性细胞的星形胶质细胞。在脑外伤后8天的病人样本中，5-LOX表达在新生的脑血管内皮细胞上。另一方面，5-LOX高度表达在高度恶性的星形胶质细胞瘤（Ⅲ/Ⅳ级）样本上，并呈颗粒状分布。这些结果显示，5-LOX在神经系统中有多种表达模式，在脑外伤和肿瘤可被诱导表达，提示5-LOX在人脑中有着重要的病理生理作用。第二部分5-脂氧酶在小鼠脑冷冻伤后的表达及其抑制剂咖啡酸的保护作用脑外伤能够引起早期的神经元损伤以及后期的星形胶质细胞增生和胶质疤痕形成。近年来的研究提示，5-LOX可能参与了脑损伤和神经退行性变的病理生理过程。咖啡酸是一种天然的多酚化合物，具有5-LOX抑制作用。本研究采用脑外伤动物模型之一的小鼠脑冷冻伤模型，研究5-LOX在脑冷冻伤后的表达特点，并着重观察5-LOX抑制剂咖啡酸在小鼠脑冷冻伤模型的早期（1天）和晚期（7～28天）的保护作用特点。双标免疫荧光实验发现，在假手术小鼠大脑皮层，5-LOX主要表达在神经元上。在冷冻伤14天后，损伤周边区存活的神经元中仍有5-LOX的表达；损伤周边区大量增生的星形胶质细胞中，5-LOX有很强的表达。咖啡酸（10和50mg/kg）能够减少冷冻伤后1天、7天、14天、21天和28天5个时间点的损伤面积。在冷冻伤后期（7至28天），咖啡酸能够减轻星形胶质细胞的增殖、胶质疤痕的形成以及GFAP的蛋白表达。另外，咖啡酸具有抗氧化特性，能够抑制脑冷冻伤1天后的超氧化物歧化酶活性的降低，并降低丙二醛含量增高。这些结果提示，5-LOX在脑损伤的早期和后期具有重要的调节作用，可能成为脑损伤新的药物作用靶点；具有脑损伤保护作用的咖啡酸可能成为治疗早期和后期脑损伤一个新的原型化合物。第三部分5-脂氧酶参与神经生长因子诱导的PC12细胞突起生长与外周神经系统不同，成年的中枢神经系统受到损伤后，神经轴突往往很难再生。因而，研究促进轴突再生的方法，对于中枢神经系统损伤（如脑外伤、脑卒中和阿尔采默氏病等）的治疗，具有重要意义。5-LOX细胞生物学研究发现，5-LOX能与生长因子受体信号转导通路关键蛋白相互作用，提示5-LOX可能作为一种细胞内结构蛋白起着非酶作用。为阐明5-LOX在脑损伤后神经功能恢复中的可能作用，本研究使用神经生长因子（NGF）诱导PC12细胞分化模型，研究5-LOX调节神经突起生长的作用特点。本研究用稳定转染和单克隆化技术，建立了稳定表达5-LOX-GFP融合蛋白和GFP的PCI2细胞株，命名为PC12-5-GFP和PC12-GFP细胞。经NGF诱导的PC12-5-LOX-GFP细胞株，其神经突起阳性细胞百分率，显著地高于PC12野生型细胞和PC12-GFP细胞株。经5-LOX反义寡核苷酸处理，PC12野生型细胞5-LOX表达降低约40％，且在NGF诱导后，神经突起阳性细胞百分率显著地低于PC12野生型细胞。但是，脂氧酶抑制剂NDGA、5-LOX抑制剂咖啡酸、12-LOX抑制剂黄芩素和CysLT1受体拮抗剂pranlukast，都不能降低NGF诱导后的神经突起生长。这些结果提示，5-LOX在NGF诱导PC12细胞细胞分化的信号通路中，可能由其非酶作用参与调节。结论1．阐明了5-LOX在相对正常、脑外伤后和星形胶质细胞瘤中的表达特点。5-LOX在脑外伤中可能参与早期的损伤作用和后期的脑重构，以及星形胶质细胞瘤的发生。2．阐明了小鼠脑冷冻伤损伤的时间过程，5-LOX在小鼠脑冷冻伤后的表达特点。5-LOX抑制剂咖啡酸对脑冷冻伤后早期和后期的神经元损伤有保护作用，并能抑制后期胶质疤痕形成。5-LOX参与调节脑损伤的早期和后期损伤，可能成为新的药物作用靶点。3．在过表达和低表达5-LOX-GFP融和蛋白的PC12细胞株，NGF诱导的PC12细胞分化随5-LOX含量增高，而细胞分化程度增加；含量减少则细胞分化程度降低。抑制5-LOX的酶活性，不能降低NGF诱导的PC12细胞分化程度。5-LOX在NGF诱导PC12细胞细胞分化的信号通路中，可能由其非酶作用参与调节。