基于肝药酶CYP450调控的花锚xanthone化合物的代谢特征评价

Xanthone论文 CYP450论文 抑制论文
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藏药花锚(Halenia elliptica, D. Don)常用于治疗肝胆疾病。我们前期的研究表明,其主要成分1-羟基-2,3,5-三甲氧基xanthone (HM-1)和1,5-二羟基-2,3-二甲氧基xanthone (HM-5)具有较好的舒张大鼠冠状动脉血管的作用。HM-5是HM-1在体内、外的主要代谢物,但HM-5与HM-1舒张大鼠冠状动脉血管的机制不同:HM-1为内皮依赖性舒张,而HM-5为非内皮依赖性机舒张。在先前的研究中,我们对HM-1基于肝药酶CYP450的部分代谢特征进行了研究总结,因此,有必要进一步完善HM-1的代谢特征,并且对与HM-1活性相似但机制不同的HM-5进行基于肝药酶CYP450的代谢特征研究,。采用大鼠肝脏微粒体、混合人肝脏微粒体及cDNA表达的重组CYP450酶,利用高效液相-离子阱-飞行时间质谱技术,研究了xanthone系列化合物HM-1、 HM-2、HM-3在大鼠体内的代谢转化;同时分别对HM-1、HM-5在大鼠肝脏CYP450酶,HM-5在人肝脏CYP450酶中的代谢途径、参与代谢的酶亚型及酶抑制情况进行研究;利用计算机辅助分子对接技术预测抑制类型,探讨抑制机理;此外还研究了HM-1(静脉给药)与花锚xanthone乙酸乙酯提取物(口服给药)在大鼠体内对CYP450酶的抑制情况,从而完善基于肝药酶CYP450的xanthone化合物代谢特征评价。实验结果表明,HM-1、HM-2、HM-3在大鼠胆汁、尿液及粪便中共检测到25个代谢产物,推测了三者在体内的代谢途径。HM-1在大鼠肝脏微粒体内共检出6个代谢产物,HM-5在大鼠肝脏微粒体内共检出3个代谢产物,在人肝微粒体中共检出2个代谢产物;HM-5在人、大鼠肝脏微粒体中的3个代谢产物均为HM-1在肝脏微粒体中代谢产物,这些代谢产物大部分为原药的去甲基或/和羟化产物。酶亚型鉴别结果表明,在大鼠肝脏微粒体中研究了CYP1A2、CYP2C6/11、 CYP2D2、CYP2E1和CYP3A2参与HM-1和HM-5代谢的情况,结果发现5种酶亚型均参与了二者的代谢;而在人肝微粒内,增加了3种酶亚型,并通过特异性抑制剂和重组酶的共同验证,发现CYP1A2, CYP2C9, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8和CYP2C19可能是参与了HM-1在人肝微粒体中代谢,而CYP1A2、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4可能是参与HM-5在人肝微粒体中代谢的主要CYP450酶亚型。抑制实验结果表明,在大鼠肝脏微粒体内,HM-1主要抑制了CYP1A2, CYP2C6/11和CYP3A2, IC50分别为34.99μM,246.37μM及14.06μM(IC20); HM-5主要抑制了CYP1A2, CYP2C6/11和CYP2D2, IC50分别为16.54μM,14.50μM (IC20)及20.91μM (IC20);在人肝微粒体中,证明了HM-1及HM-5对CYP3A4没有时间依赖性作用;同时HM-5对CYP1A2, CYP2D6及CYP3A4表现出混合性抑制作用,抑制常数Ki分别为23.13μM,15.19μM;同时,这一抑制作用借助分子对接技术进行了模拟,从而阐述其抑制机理。大鼠CYP450酶的体内抑制实验表明,HM-1和xanthone乙酸乙酯提取物均对仅对CYP3A2表现出抑制作用。综上所述,xanthone化合物在肝脏内是多个CYP450酶亚型参与代谢的过程;在体外,HM-5的代谢产物与其代谢原型HM-1相似,但在抑制效果和抑制类型上有所不同;在大鼠体内,CYP3A2可被HM-1和花锚乙酸乙酯提取物抑制。这些工作将为全面评价HM-1和HM-5的代谢特征提供科学参考,并为归纳花锚xanthone类化合物基于肝药酶CYP450的代谢特征提供依据。
摘要第9-11页
ABSTRACT第11-12页
第一章 绪论第13-34页
    1. CYP450酶概述第13-16页
        1.1 CYP450酶第13-14页
        1.2 CYP450酶的分类第14页
        1.3 CYP450酶的特性第14-15页
            1.3.1 遗传多态性第14-15页
            1.3.2 酶的诱导和抑制第15页
        1.4 CYP450酶在人体的表达及作用第15-16页
    2. 天然产物有效成分与CYP450酶相互作用的研究进展第16-18页
        2.1 作用于中枢神经系统药物第16-17页
        2.2 作用于心血管系统药物第17页
        2.3 抗菌药物第17页
        2.4 作用于免疫系统药物第17页
        2.5 小结第17-18页
    3. CYP450酶体外代谢研究进展第18-23页
        3.1 CYP450酶体外代谢模型及方法第18-19页
            3.1.1 肝脏微粒体温孵法第18页
            3.1.2 肝细胞体外温孵法第18页
            3.1.3 肝脏灌流法第18-19页
            3.1.4 肝组织切片法第19页
            3.1.5 基因重组P450酶系第19页
        3.2 CYP450酶体外代谢检测方法第19-20页
            3.2.1 高通量检测方法第19-20页
            3.2.2 中等通量检测方法第20页
        3.3 CYP450酶抑制作用研究方法第20-23页
            3.3.1 可逆性抑制研究方法第21-22页
            3.3.2 时间依赖性抑制研究方法第22-23页
    4. 分子对接技术在CYP450酶代谢研究中的应用第23-29页
        4.1 分子对接方法第25-27页
        4.2 分子对接软件第27-29页
    5. 立题背景及意义第29-32页
    6. 目标与策略第32-34页
第二章 花锚活性xanthone成分HM-1、HM-2、HM-3在大鼠体内的代谢转化研究第34-50页
    1. 实验材料第34页
        1.1 药品与试剂第34页
        1.2 仪器第34页
        1.3 动物第34页
    2 实验方法第34-36页
        2.1 血浆样品采集及预处理第34-35页
        2.2 胆汁样品采集及预处理第35页
        2.3 尿液样品采集及预处理第35页
        2.4 粪便样品采集及预处理第35页
        2.5 LC/MS~n-IT-TOF条件第35-36页
    3. 实验结果与讨论第36-40页
        3.1 HM-1在大鼠体内的代谢转化研究第36-37页
            3.1.1 HM-1在大鼠体内代谢产物结构解析第36-37页
            3.1.2 大鼠血浆样品的分析第37页
            3.1.3 大鼠胆汁样品的分析第37页
            3.1.4 大鼠尿液样品的分析第37页
            3.1.5 大鼠粪便样品的分析第37页
            3.1.6 HM-1在大鼠体内代谢产物结构解析及代谢途径的推测第37页
        3.2 HM-2在大鼠体内的代谢转化研究第37-39页
            3.2.1 HM-2在大鼠体内代谢产物结构解析第37-38页
            3.2.2 大鼠血浆样品的分析第38页
            3.2.3 大鼠胆汁样品的分析第38页
            3.2.4 大鼠尿液样品的分析第38页
            3.2.5 大鼠粪便样品的分析第38-39页
            3.2.6 HM-2在大鼠体内代谢产物的结构解析及代谢途径的推测第39页
        3.3 HM-3在大鼠体内的代谢转化研究第39-40页
            3.3.1 HM-3在大鼠体内代谢产物结构解析第39页
            3.3.2 大鼠血浆样品的分析第39页
            3.3.3 大鼠胆汁样品的分析第39-40页
            3.3.4 大鼠尿液样品的分析第40页
            3.3.5 大鼠粪便样品的分析第40页
            3.3.6 HM-3在大鼠体内代谢产物的结构解析及代谢途径的推测第40页
    4. 小结第40-42页
    附图表第42-50页
第三章 花锚活性xanthone成分HM-1与HM-5在肝脏微粒体中的代谢转化研究第50-61页
    1. 实验材料第50-51页
        1.1 药品与试剂第50页
        1.2 仪器第50-51页
        1.3 动物第51页
    2. 实验方法第51-52页
        2.1 大鼠肝微粒体的制备第51页
        2.2 大鼠及人肝脏微粒体温孵体系及预处理第51页
        2.3 LC/MS~n-IT-TOF分析条件第51-52页
    3. 实验结果与讨论第52-54页
        3.1 HM-1在大鼠肝脏微粒体中的代谢转化研究第52-53页
            3.1.1 HM-1在大鼠肝脏微粒体中代谢产物的结构解析第52-53页
            3.1.2 HM-1在肝脏微粒体中代谢途径的推测第53页
        3.2 HM-5在肝脏微粒体中的代谢转化研究第53-54页
            3.2.1 HM-5在大鼠肝脏微粒体中代谢产物的结构解析第53页
            3.2.2 HM-5在人肝脏微粒体中代谢产物的结构解析第53页
            3.2.3 HM-5在肝脏微粒体中代谢途径的推测第53-54页
    4. 小结第54-55页
    附图表第55-61页
第四章 参与HM-1与HM-5在肝微粒体中代谢的CYP450酶亚型的鉴定第61-79页
    1. 实验材料第61-62页
        1.1 药品与试剂第61页
        1.2 仪器第61页
        1.3 动物第61-62页
    2. 实验方法第62-63页
        2.1 大鼠肝脏微粒体的制备第62页
        2.2 特异性抑制剂法在大鼠及人肝脏微粒体中的温孵体系及预处理第62页
        2.3 重组CYP450酶法的温孵体系及预处理第62页
        2.4 HPLC-UV分析条件第62-63页
        2.5 数据处理第63页
    3. 实验结果及讨论第63-77页
        3.1 参与HM-1代谢的主要CYP450酶亚型的鉴别第63-68页
            3.1.1 特异性抑制剂法鉴别在大鼠肝脏微粒体中主要参与的CYP450酶亚型第63-66页
            3.1.2 重组CYP450酶法鉴别在人肝微粒体中主要参与的CYP450酶亚型第66-68页
        3.2 参与HM-5代谢的主要CYP450酶亚型的鉴别第68-77页
            3.2.1 特异性抑制剂法鉴别在大鼠肝脏微粒体中主要参与的CYP450酶亚型第68-72页
            3.2.2 特异性抑制剂法鉴别在人肝脏微粒体中主要参与的CYP450酶亚型第72页
            3.2.3 重组CYP450酶法鉴别在人肝脏微粒体中主要参与的CYP450酶亚型第72-77页
    4. 小结第77-79页
第五章 HM-1和HM-5对CYP450酶的体外抑制作用研究第79-98页
    1. 实验材料第79页
        1.1 药品与试剂第79页
        1.2 仪器第79页
        1.3 动物第79页
    2. 实验方法第79-84页
        2.1 大鼠肝脏微粒体的制备第79页
        2.2 HM-1与HM-5对CYP3A4时间依赖性抑制作用的研究第79-80页
            2.2.1 温孵体系及预处理第79-80页
            2.2.2 HPLC-UV分析方法第80页
            2.2.3 数据处理第80页
        2.3 探针底物法测定HM-1与HM-5在体外对CYP450酶的抑制第80-84页
            2.3.1 探针底物药物的HPLC-UV分析方法的建立第80-82页
                2.3.1.1 CYP1A2及CYP3A4(CYP3A2)探针底物药物分析方法的建立第80-81页
                2.3.1.2 CYP286探针底物药物分析方法的建立第81页
                2.3.1.3 CYP2C8探针底物药物分析方法的建立第81页
                2.3.1.4 CYP2C9(CYP2C6/11)探针底物药物分析方法的建立第81页
                2.3.1.5 CYP2C19探针底物药物分析方法的建立第81页
                2.3.1.6 CYP2E1探针底物药物分析方法的建立第81-82页
                2.3.1.7 CYP3A4(CYP3A2)探针底物药物分析方法的建立第82页
            2.3.2 IC_(50)的测定第82-83页
                2.3.2.1 探针底物与抑制剂的浓度设置第82页
                2.3.2.2 温孵体系及预处理第82-83页
                2.3.2.3 数据处理第83页
            2.3.3 抑制类型的判定第83-84页
                2.3.3.1 温孵体系及预处理第83页
                2.3.3.2 数据处理第83-84页
    3. 实验结果及讨论第84-94页
        3.1 HM-1和HM-5对CYP3A4时间依赖性抑制作用的研究第84-85页
        3.2 探针底物法测定HM-1与HM-5在体外对CYP450酶的抑制第85-94页
            3.2.1 探针底物药物的HPLC-UV分析方法的验证结果第85-90页
            3.2.2 HM-1对大鼠肝脏微粒体CYP450酶的抑制作用研究第90-91页
                3.2.2.1 IC_(50)的测定第90-91页
            3.2.3 HM-5对大鼠肝脏微粒体CYP450酶的抑制作用研究第91-92页
                3.2.3.1 IC_(50)的测定第91-92页
            3.2.4 HM-5对人肝脏微粒体CYP450酶的抑制作用研究第92-94页
                3.2.4.1 IC_(50)的测定第92-93页
                3.2.4.2 抑制类型的判定第93-94页
    4. 小结第94-98页
第六章 HM-1及花锚乙酸乙酯提取物对大鼠主要CYP450酶亚型的体内抑制作用研究第98-108页
    1. 实验材料第98页
        1.1 药品与试剂第98页
        1.2 仪器第98页
        1.3 动物第98页
    2. 实验方法第98-101页
        2.1 HM-1对大鼠CYP1A2,CYP2C6/11,CYP3A2体内抑制作用的研究第98-99页
        2.2 花锚乙酸乙酯提取物对大鼠CYPlA2,CYP2C6/11,CYP3A2体内抑制作用的研究第99-100页
        2.3 探针底物药物的HPLC-UV分析方法的建立第100-101页
            2.3.1 CYP1A2探针底物药物分析方法的建立第100页
            2.3.2 CYP2C6/11探针底物药物分析方法的建立第100页
            2.3.3 CYP3A2探针底物药物分析方法的建立第100-101页
        2.4 数据处理第101页
    3. 实验结果及讨论第101-107页
        3.1 探针底物药物的HPLC-UV分析方法的验证结果第101-103页
        3.2 HM-1与花锚乙酸乙酯提取物对大鼠CYP1A2,CYP2C6/11,CYP3A2体内抑制作用研究结果第103-107页
    4. 小结第107-108页
第七章 分子对接技术在研究人CYP450酶抑制作用中的应用第108-115页
    1. 实验材料第108页
        1.1 工作站及原文件第108页
    2. 实验方法第108-109页
        2.1 HM-5与CYP450蛋白晶体结构的对接第108页
        2.2 对接结果的处理第108-109页
    3. 实验结果与讨论第109-113页
        3.1 HM-5与人肝脏CYP1A2,CYP2C9,CYP3A4蛋白晶体对接能量结果第109页
        3.2 HM-5对人肝脏CYP1A2,CYP2C9,CYP3A4抑制机理的探讨第109-113页
            3.2.1 HM-5对人肝脏CYP1A2抑制机理的探讨第109页
            3.2.2 HM-5对人肝脏CYP2C9抑制机理的探讨第109-110页
            3.2.3 HM-5对人肝脏CYP3A4抑制机理的探讨第110-113页
    4. 小结第113-115页
第八章 总结第115-117页
参考文献第117-125页
发表论文、参会、学术交流及获奖情况第125-127页
致谢第127-128页
论文购买
论文编号ABS4259540,这篇论文共128页
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