亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease, HD)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病,由编码亨廷顿蛋白(huntingtin, Htt)的HD基因中CAG重复序列异常增多所致。临床上主要表现为运动失调、认知异常及精神障碍,病理学上以大脑皮质、纹状体等脑区神经元选择性丢失为特征。HD早期症状的出现与突触功能的异常有关,突变Htt对突触功能具有明显的毒性。锌元素是人体内生命活动中必不可少的微量元素之一。人体内85%的锌离子通过与其结合蛋白结合而以结合形式存在,作为游离锌离子的一种储备形式,15%的锌离子以游离的形式存在。在脑内,约超过95%的游离锌离子存在于突触小泡内。在突触活动中,突触小泡内的游离锌离子与神经递质共同释放到突触间隙,参与调控多种突触后受体的功能,因此,锌离子稳态在突触传递调节中具有重要作用。游离锌离子不能通过被动扩散通过细胞膜,其向细胞内外的转运依赖于锌离子转运体(zinc transporter)。锌离子转移转运体3(zinc transporter 3, ZnT3)与游离锌离子在突触小泡内的富集有关,细胞内ZnT3的表达水平影响细胞内游离锌离子的浓度。在多种神经退行性疾病中均有脑内锌离子稳态紊乱,但HD脑内是否有游离锌离子水平的改变,突变Htt是否通过影响ZnT3的表达改变游离锌离子水平目前未见报道。本研究利用HD转基因小鼠和转染表达突变Htt的细胞模型,观察了突变Htt对游离锌离子水平及ZnT3表达的影响及其机制,结果表明,突变Htt可通过影响Spl与ZnT3基因启动子序列的结合能力,下调ZnT3的表达,降低游离锌离子水平。1.HD转基因小鼠脑内游离锌离子水平降低为了观察突变Htt是否影响脑内锌离子水平,首先应用原子吸收分光光度法检测了HD转基因小鼠脑内锌元素总量。结果显示,与野生型(wild type, WT)小鼠比较,HD转基因(TG)小鼠脑皮质、纹状体和海马等脑区内的锌元素总量明显降低；应用游离锌离子金属自显影(AMG)技术对HD转基因小鼠脑内游离锌离子检测结果显示,TG小鼠中皮质、海马、纹状体、外侧苍白球、内侧苍白球和黑质等部位游离锌离子表达较WT小鼠相应脑区显著降低。由此提示,突变Htt可破坏脑内锌离子稳态并由此影响突触传递功能。2.突变Htt下调ZnT3表达脑组织内游离锌离子不能自由通过细胞膜,必须依靠锌离子转运体转运而进入细胞内。为了明确突变Htt是否通过影响ZnT3的表达使锌离子转运障碍而降低游离锌离子水平,对TG小鼠和HD细胞模型中ZnT3的表达水平进行了检测。免疫印迹检测显示,与WT小鼠比较,TG小鼠皮质、纹状体、海马等脑区的ZnT3表达在14周已经明显降低,在18周和20周降低更加明显；与转染正常Htt(20Q)的BHK细胞比较,转染突变Htt(160Q)的BHK细胞中ZnT3蛋白表达水平在转染24 h后降低,转染48 h和72 h后降低更为明显。RT-PCR检测显示,TG小鼠皮质、纹状体、海马等脑区和转染表达突变Htt的BHK细胞中ZnT3 mRNA水平的变化与蛋白水平变化一致。免疫组织化学检测结果显示,TG小鼠纹状体、外侧苍白球、内侧苍白球、黑质网状部、海马等脑区的ZnT3免疫反应性较WT小鼠相应区域明显减弱。以上结果提示,突变Htt可能通过抑制ZnT3基因转录而下调ZnT3的表达,突变Htt降低TG小鼠脑内游离锌离子水平的效应与其抑制ZnT3的表达而减少游离锌离子的转运有关。3.Sp1调控ZnT3基因转录突变Htt能通过影响转录因子的活性影响多种基因的转录。为了明确突变Htt是否通过影响调控ZnT3基因的转录因子活性抑制ZnT3基因的转录,对调控ZnT3基因的转录因子进行了分析。生物信息学分析显示,ZnT3基因启动子区域含有Sp1、WT1+KTS、WT1-KTS,、NF-κB p50 (NF-κB p50)、NF-κB p65等转录因子的可能结合基序,其中Sp1与NF-κB p65的评分较高。分别构建相关转录因子的质粒并转染BHK细胞后应用免疫印迹检测发现,在BHK细胞系中过表达Sp1对ZnT3的表达有上调作用,而过表达其它转录因子对ZnT3的表达无明显影响。进一步的免疫印迹和RT-PCR检测显示,在BHK细胞系中过表达Spl可使ZnT3的蛋白表达和(?)nRNA水平明显升高,而沉默Spl后,ZnT3的蛋白表达和mRNA水平则明显下调。双荧光素酶报告基因检测显示,过表达Spl后含pGL3-ZnT3(-283～+10)和pGL3-ZnT3(-193～+10)报告基因的荧光素酶活性明显升高,而含pGL3-ZnT3(-171～+10)报告基因的荧光素酶活性无改变。以上结果提示含有Spla和Splb的ZnT3基因启动子区(-184～-174bp)、(-269～-261bp)是Spl调控ZnT3基因转录的必须位点。而用染色质免疫共沉淀(Chromatin Imunoprecipitation, ChIP)技术检测出具有Spl作用基序的ZnT3基因启动子序列区片段能与Spl直接结合。这些结果提示Spl可与ZnT3基因启动子上的(-338～-232 bp)和(-253～-112 bp)基序结合来激活ZnT3基因的转录。4.突变Htt抑制Spl与ZnT3基因启动子序列的结合为了进一步证明突变Htt通过转录因子Spl抑制ZnT3基因的转录,将表达正常Htt的质粒(pJRed-20 Q-Htt)(?)(?)表达突变Htt的质粒(pJRed-160 Q-Htt)分别与ZnT3启动子中的(-283～+10 bp)片段克隆成的pGL3-basic荧光素酶报告基因质粒共转染BHK细胞后发现,突变Htt (pJRed-160 Q-Htt)使荧光素酶活性较对照组(pJRed-20Q-Htt)的荧光素酶活性较明显减弱,并呈浓度依赖性。而同时过表达外源性pEBGN-Spl和pJRed-160 Q-Htt质粒后的BHK细胞荧光素酶活性与同时过表达pJRed-20 Q-Htt和pEBGN空载质粒的BHK细胞荧光素酶活性相比无显著性差异,由此表明突变Htt可能通过抑制Spl的表达抑制ZnT3的转录。用RT-PCR和免疫印迹检测突变Htt对Spl mRNA和蛋白表达的影响后发现,TG小鼠脑组织中和表达pJRed-160 Q-Htt的BHK细胞中Sp1 mRNA和蛋白表达水平较WT小鼠和表达pJRed-20 Q-Htt的BHK细胞明显升高,TG小鼠脑组织Spl免疫反应性的免疫组织化学检测进一步证实,突变Htt可使Spl蛋白水平明显升高。因此,突变Htt不仅未抑制Spl的表达,反而对Spl的表达具有上调作用。为了解释在TG小鼠中Spl表达水平升高而其调控的下游基因ZnT3却表达下降这一现象,应用ChIP技术检测了突变Htt对Spl与ZnT3基因启动子结合能力的影响,结果表明,突变Htt使Spl与ZnT3基因启动子序列的结合能力明显减弱。本研究结果表明,突变Htt通过抑制转录因子Sp1与ZnT3基因启动子的结合而抑制Sp1对ZnT3基因转录的激活作用,从而导致ZnT3基因的转录和表达下降,进而引起游离锌离子向突触小泡内的转运障碍,突触小泡内游离锌离子减少。突触小泡内游离锌离子减少将导致突触传递功能障碍。因此,本研究为揭示HD脑内突触传递功能障碍的机制提供了新的实验依据。
