高压氧治疗神经病理性痛的可行性研究及其机制探讨

神经病理性痛的发病机制和治疗是医学和生物学中最富挑战的问题之一。神经病理性痛发病率高，且严重降低患者的健康相关生活质量（health-related quality of life，HRQoL）。当前神经病理性痛的治疗并不令人满意，超过2/3的病人不能获得有效的减轻疼痛的治疗。国际疼痛研究学会（InternationalAssociation for the Study of Pain，IASP）指出，神经病理性痛诊疗中“来自临床的挑战是对疼痛病因的鉴别和改善”。疗效是一个临床学科成长的硬道理，针对病理性痛产生的根本因素的治疗才能得到最佳的疗效。我们基于前期实验探索和文献分析提出：感觉神经损伤可能是神经病理性痛的根本病因。这一观点与领域内理念的变更不谋而合。2011年IASP修改了沿用17年的概念，将神经病理性疼痛明确定义为：“由躯体感觉神经系统的损伤和疾病而直接造成的疼痛”。大多数既往神经病理性痛的研究多集中在“神经系统损伤后发生的不良适应性反应”，这意味着默认最初决定并诱发神经病理性痛的感觉神经损伤已经康复，因而完全忽略了感觉神经损伤这一最根本病因。临床治疗效果不佳的现状提醒我们这些观点的单一性和片面性。我们从根本病因入手，提出“用神经保护手段/药物治疗神经损伤，缓解病理性痛”这一值得探索的新思路。高压氧作为一种临床常用的治疗手段，已被广泛用于多种中枢/周围神经损伤疾病的治疗。有研究表明，高压氧可缓解动物炎性痛，在治疗患者偏头痛和复杂性区域疼痛综合症方面具有一定疗效。但是目前鲜有科学研究高压氧治疗神经病理性痛的文献报道。我们研究团队长期致力于神经保护及机制的研究。在国际上率先报道了高压氧预处理可减轻脑、脊髓缺血再灌注损伤，具有较强的神经保护作用。那么，从感觉神经损伤这一根本病因入手，使用高压氧早期减轻损伤程度，晚期促进损伤修复，能否缓解缓解/治疗神经病理性痛呢？本课题是“神经保护策略治疗神经病理性痛”思路的延续和深入探索，旨在从多角度全面深入论证高压氧治疗神经病理性痛的可行性，并初步探讨其机制，为最终的临床应用提供科学依据。【研究目的】从整体动物行为、细胞和分子生物标志物、关键信号通路三个层次，论证高压氧治疗神经病理性痛的可行性。探讨NMDA、Sirt1是否参与了高压氧的镇痛机制。【研究方法】在神经损伤后早期（CCI术后30分钟内）或痛敏形成后晚期（CCI术后第14天）给予3ATA、纯氧的高压氧治疗。运用行为学方法测量大鼠50%机械刺激缩足反射阈值和热刺激缩足潜伏期，观察不同阶段高压氧治疗对神经病理性痛大鼠的热、机械痛阈的影响；运用免疫荧光染色的方法，观察不同阶段高压氧治疗对神经病理性痛大鼠脊髓背角浅层c-fos表达和星型胶质细胞活化状态的影响；运用Western blot方法，检测不同时间点高压氧治疗对神经病理性痛大鼠脊髓pNR1、pNR2B、pCaMKⅡ、pERK、pCREB和GFAP蛋白表达水平的影响；观察周围神经损伤（CCI、SNL）对大鼠脊髓Sirt1蛋白水平的影响以及高压氧的作用。【研究结果】第一部分高压氧治疗可显著缓解CCI大鼠的神经病理性痛。早期重复高压氧治疗可诱导长时程的镇痛作用，显著降低了CCI大鼠热痛敏和机械性痛觉超敏的严重程度，缩短了病程。与CCI模型组相较，在早期重复高压氧治疗后的前两周，热刺激缩足反射潜伏期代表的热痛敏降低了大约70%。此外，早期重复高压氧治疗将热痛敏的病程缩短到了两周，而CCI模型组大鼠的神经病理性痛状态至少持续五周以上。与缓解热痛敏作用类似，早期重复高压氧治疗对机械性痛觉超敏同样具有有效的缓解作用。晚期重复高压氧治疗（连续3天）可发挥显著但相对短暂的抑制热痛敏和机械性痛觉超敏的作用。在末次高压氧治疗结束后，这种抑制作用仍可持续大约5-8天。延长高压氧治疗疗程至7天可产生持久的抑制作用，镇痛作用的程度与连续治疗三天的效果相似，持续时间在末次高压氧治疗后可维持两周左右。第二部分与Sham组相比，CCI诱导的神经病理性痛大鼠脊髓背角浅层c-Fos大量阳性表达，时程上呈双波峰形式。CCI术后第3天，CCI组大鼠脊髓背角Ⅰ-Ⅴ层c-Fos阳性细胞核数目明显增多，为21.67±2.02个，与Sham组比较具有统计学意义。CCI术后第14，17，21天，CCI组大鼠脊髓背角c-Fos阳性细胞核数目再次增多，分别为51.25±5.64个、57.56±8.32个、54.00±5.93个。CCI术后第24天，CCI组大鼠脊髓背角c-Fos阳性细胞核数目基本回落至正常。早期高压氧治疗显著降低了CCI大鼠术后第14天的脊髓背角Ⅰ-Ⅴ层c-Fos阳性细胞核数目，从51.25±5.64个降低至17.79±1.68个，抑制比例高达65.3%。晚期重复高压氧治疗也可显著抑制CCI大鼠脊髓背角浅层c-Fos的表达。CCI手术可显著激活脊髓背角浅层星型胶质细胞。与CCI组相比，早期高压氧治疗显著降低了CCI大鼠术后第14、28天的脊髓背角Ⅰ-Ⅲ层的GFAP荧光强度，抑制比例分别为44.8%和38.7%。阳性细胞计数结果基本类似。晚期高压氧治疗延迟性轻度抑制CCI大鼠术后第24天脊髓背角浅层星型胶质细胞的活化。Western blot结果和免疫组化结果基本一致。与CCI组相比，早期重复高压氧治疗可显著降低术后第14天术侧脊髓GFAP蛋白表达水平。而在术后第17天，晚期期高压氧治疗则未能明显降低术侧脊髓GFAP的蛋白表达。CCI可显著上调大鼠术侧脊髓pERK蛋白表达水平。在术后第14天，早期重复高压氧治疗的e-HBO组大鼠的术侧脊髓pERK蛋白表达水平明显低于CCI模型组。晚期高压氧治疗可显著抑制CCI大鼠术后第17天的pERK蛋白表达。第三部分早期重复高压氧治疗可有效抑制CCI诱导的大鼠术侧脊髓pNR2B上调，但对pNR1的上调抑制作用不明显。晚期高压氧治疗显著降低了CCI大鼠术后第17天的术侧脊髓pNR2B蛋白表达的上调（p＜0.05），还抑制了pNR1的蛋白表达上调（p＜0.001）。高压氧治疗可有效抑制CCI诱导的大鼠术侧脊髓pCaMKⅡ的上调。自术后第14天起，CCI组大鼠术侧脊髓pCREB蛋白表达水平较Sham组明显增高（p＜0.05），于术后第24天达到峰值并维持至最长观察点。早期高压氧治疗将CCI大鼠脊髓pCREB的表达高峰提前至术后第14天。晚期高压氧治疗显著降低了CCI大鼠术后第17，21天的术侧脊髓pCREB蛋白表达的上调。第四部分周围神经损伤诱发的神经病理性痛CCI大鼠在术后12小时即出现Sirt1蛋白表达下降，第3-5天达到最低。CCI术后第5天，高压氧治疗部分逆转周神经损伤诱发的Sirt1蛋白表达水平的降低。【结论】高压氧治疗神经病理性痛有效。早期高压氧治疗具有镇痛作用，可长时程地减轻CCI大鼠热痛敏和机械性痛觉超敏的严重程度，缩短病程。晚期高压氧治疗可产生显著但相对短暂的镇痛作用，其镇痛时程和疗程之间存在剂量依赖性，增加晚期高压氧治疗次数可延长镇痛时间。高压氧治疗可显著抑制CCI引起的c-Fos表达和pERK表达水平的上调。早期高压氧治疗可有效抑制术侧脊髓背角星形胶质细胞的活化。这些结果从细胞和分子的生物标志物的角度进一步验证了高压氧的镇痛作用。高压氧可明显抑制CCI诱导的pNR2B、pCaMKⅡ、pCREB表达水平上调，提示其镇痛作用可能通过NMDA受体及其下游钙离子依赖性的CaMKⅡ/ERK-CREB通路实现的。周围神经损伤可显著抑制大鼠脊髓Sirt1蛋白表达，高压氧治疗可部分逆转周神经损伤诱发的Sirt1蛋白表达水平降低，提示Sirt1可能参与了高压氧的镇痛机制，但具体机制尚需进一步研究论证。