黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)系虎耳草科茶藨子属小灌木果树。黑龙江省栽培面积较大,品种资源丰富,是寒地优势果树树种之一。其果实为浆果,富含花色苷等酚类物质,这些酚类物质的存在不仅影响黑穗醋栗制品的色泽,也具有预防心脑血管疾病和抗癌等多种生理功效,已引起国内外学者的广泛关注。本研究以黑穗醋栗果实为研究对象,从果实经济性状的角度系统评价了东北农业大学黑穗醋栗种质资源圃中的26个品种资源；采用HPLC-MS/MS技术定性、定量分析了26个黑穗醋栗品种成熟果实的果皮中花色苷和非花色苷酚的种类和含量,揭示了不同品种资源成熟果皮中花色苷和非花色苷酚种类、组成和含量等方面的差别；利用RT-PCR和RACE技术从黑穗醋栗果皮中克隆得到了RnANS1、RnF3’5’H1、RnF3’H1和RnDFR1等四个与花色苷合成相关的结构基因,并进行了相应的生物信息学分析；应用实时荧光定量PCR,分析了RnANS1、 RnF3’5’H1、RnF3’H1和RnDFR1等四个基因在黑穗醋栗果实转色期的表达情况。主要研究结果如下：按照等距分组法,统计黑穗醋栗果实经济性状数值的次数分布,采用1-5级分级系统,提出了果穗重量、百果重、花色昔含量、果穗长度、有机酸含量、可溶性糖含量等6个性状的分级标准。应用主成分分析法,确定了影响黑穗醋栗果实经济性状评价的主要指标是果穗重量、花色苷含量、可溶性糖含量和有机酸含量。应用因子分析法,明确了各公因子反映黑穗醋栗果实经济性状的情况,第一公因子是果穗重量和百果重,第二公因子是果实中可溶性糖含量和花色苷含量。从果实经济性状的角度,对黑穗醋栗品种进行了综合评价,认为‘亚德列娜娅’、‘索菲亚’、‘金大粒’、‘格鲁布基’、‘乌苏里’等品种果实综合经济性状较优。26个黑穗醋栗品种成熟果实的果皮中共检测到33种花色苷,其中双糖苷2种,单糖苷14种；二糖苷10种；三糖苷1种；未鉴定的花色苷6种；吡喃型花色昔10种。大多数黑穗醋栗品种能检测到20种左右花色苷,花色苷种类最丰富的品种是‘格鲁布基’；黑穗醋不同品种成熟果实的果皮中花色苷组成异常复杂,26个黑穗醋栗品种共有的花色苷11种。花翠素类花色苷和花青素类花色苷及葡萄糖苷和芸香糖苷类型的花色苷所占比重较大。大多品种果皮中花色苷含量在30mg/g～40mg/g之间。‘滨海明珠’、‘戈金鹦鹉’、‘黑斯密’、‘白俄罗斯甜’和‘慈鸽实生’等5个品种果皮中花色苷含量较为丰富。花色素二糖苷的含量显著高于花色素单糖苷的含量,花翠素和花青素类花色苷的含量在花色苷总量中占绝对优势。主成分分析表明：花青素类、甲基花翠素类、二甲花翠素类和花翠素类花色苷对黑穗醋栗果皮中花色苷的组成起决定性作用。26个黑穗醋栗品种可以聚为两大类,‘早生黑’、‘乌苏里’、‘奥依宾’、‘利桑佳’、‘布劳德’、‘黛沙’、‘巴基拉’等7个品种为第一类；其余19个品种为第二类。26个黑穗醋栗品种成熟果实的果皮中共检测到10种非花色苷酚化合物,其中黄酮醇类非花色苷酚类物质9种。大多数品种的果皮中能检测到4-5种非花色苷酚类化合物；杨梅酮类非花色苷酚在大多数品种的果皮中均能检测到。‘格鲁布基’、‘戈金鹦鹉’和‘滨海明珠’等三个品种果皮中非花色苷酚含量较为丰富。采用改良CTAB法,从‘布劳得’成熟果皮中提取总RNA,反转录成cDNA。利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到黑穗醋栗果实中花青素合成酶(RnANS1)、类黄酮-3’,5’-羟化酶(RnF3’5’H1)、类黄酮-3’-羟化酶(RnF3’H1)和二氢黄酮醇-4-还原酶(RnDFR1)等4个基因的cDNA全长序列,GenBank登录号分别为KC493686、 KC493688、KC493689和KC493687。利用生物信息学分析方法,推测4个基因是分别编码357、509、524和366个氨基酸残基的多肽,分子量分别为40.51 kDa、 57.12kDa、58.40kDa和40.57kDa。各基因与其他物种相关基因的相似性均超过70%,构建了4个基因与其他物种相应基因的分子进化树,分析了亲缘关系。分析了各基因的信号肽结构和疏水性,初步预测了蛋白质二级结构。黑穗醋栗果实中相关结构基因在果实转色过程中的表达特性如下：①果实着色过程中,RnANS1呈上调表达趋势,果实成熟时转录水平最高；②果实着色后,RnF3’5’H1呈上调表达趋势,果实50%和80%着色时,RnF3’5’H1的表达量基本处于最高水平,果实成熟时转录水平有所降低；③果实着色后,RnF3’H1下调表达,果实着色达到一定程度后,呈上调表达趋势,果实80%着色时,转录水平最高,果实成熟时转录水平较低；④随着果实着色度的加深,RnDFR1呈上调表达趋势,果实80%着色时,转录水平最高,果实成熟时转录水平较低。RnANS1和RnF3’5’H1的转录水平与花色苷和可溶性固形物含量呈正相关关系,与果实pH值之间不存在相关关系。RnF3’5’H1的表达在黑穗醋栗果实花色苷合成中具有至关重要的作用。RnF3’H1和RnDFR1的转录水平与花色苷含量、可溶性固形物含量和pH值之间不存在相关关系。RnF3’H1所编码的类黄酮3’-羟化酶和RnDFR1所编码的二氢黄酮醇4-还原酶不是黑穗醋栗果实中花色苷合成的关键酶。
