Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2甘氨酸甜菜碱转运基因的克隆与渗透胁迫响应

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Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2是一株在高盐条件下有效降解苯酚的革兰氏阳性中度嗜盐菌,可应用于高盐有机废水的处理。中度嗜盐菌主要通过自身合成或转运相容性溶质来实现耐盐,对于PDB-F2转运相容性溶质的耐盐机制的研究还很少。本文主要对PDB-F2转运甘氨酸甜菜碱的耐盐机制进行了研究,丰富了中度嗜盐菌V.halodenitrificanPDB-F2耐盐机制的理论研究,对于PDB-F2应用于高盐有机废水的处理以及利用合成生物学加强普通降解菌的耐盐性能具有重要意义。本文首先通过核磁共振(NMR)确定了V.halodenitrificans PDB-F2在高盐条件下对甘氨酸甜菜碱的转运,与自身合成四氢嘧啶相比,PDB-F2会优先转运外界的甘氨酸甜菜碱以抵抗渗透胁迫,外源添加的甜菜碱会抑制PDB-F2胞内四氢嘧啶的合成。外源甘氨酸甜菜碱对PDB-F2的渗透保护作用的研究结果表明,甜菜碱显著提升了 PDB-F2在6%-15%NaCl盐度下的耐盐生长性能与耐受盐度,其最大耐受盐度达15%NaCl。利用E.col MKH13因相容性溶质合成基因与转运基因存在缺陷而不能于4%NaCl盐度下生长的特点,对V.halodenitrificans PDB-F2全基因组预测的转运基因betL,opuD1,opuD2和opuD3进行了功能验证,证明了它们是编码甜菜碱转运蛋白的基因。而且通过E.coli MKH13测定了 BetL、OpuD1、OpuD2和OpuD3对甜菜碱的亲和性,其亲和力大小依次为BetL>OpuD1>OpuD3>OpuD2。利用实时荧光定量PCR对V.halodenitrificans PDB-F2转运基因betL,opuD1,opuD2和opuD3转录水平的研究表明,转运基因的转录水平与胞内甜菜碱的含量随着盐度的增加而增加,betL、opuD1和opuD3的最大值均在12%NaCl盐度下,说明转运基因的转录水平和甜菜碱的转运量取决于外部施加的渗透胁迫的程度。转运基因由NaCl诱导表达,而甜菜碱对于基因转录表达虽然没有诱导作用,但是影响转运基因的转录水平,其最大的转录水平发生于NaCl与甜菜碱共同存在的条件下,且转运基因对甘氨酸甜菜碱具有转录特异性;外界渗透胁迫引起的V.halodenitrificans PDB-F2甜菜碱转运,不仅依赖于渗透刺激引起的的转运基因转录,而且与被刺激的转运蛋白活性水平有关。
摘要第5-6页
Abstract第6-7页
第1章 前言第11-25页
    1.1 研究背景与意义第11-12页
        1.1.1 研究背景第11页
        1.1.2 研究意义第11-12页
    1.2 中度嗜盐菌概述第12-15页
        1.2.1 中度嗜盐菌的定义和分类第12-13页
        1.2.2 中度嗜盐菌的应用第13-14页
        1.2.3 中度嗜盐菌的耐盐机制第14-15页
    1.3 相容性溶质耐盐机制概述第15-22页
        1.3.1 相容性溶质种类和作用机制第15-17页
        1.3.2 相容性溶质耐盐机理第17-19页
        1.3.3 相容性溶质的合成与转运第19-22页
    1.4 相容性溶质转运系统概述第22-24页
        1.4.1 相容性溶质转运系统分类第22-23页
        1.4.2 BCCT转运家族的特点第23页
        1.4.3 相容性溶质转运系统的调控第23-24页
    1.5 研究目的及内容第24-25页
        1.5.1 研究目的第24页
        1.5.2 研究内容第24-25页
第2章 实验材料及分析方法第25-31页
    2.1 实验试剂及配制方法第25-28页
        2.1.1 实验试剂第25-27页
        2.1.2 培养基及其配制第27-28页
        2.1.3 试剂配制及保存第28页
    2.2 实验仪器和设备第28-29页
    2.3 分析方法第29-31页
第3章 甜菜碱对V. halodenitrificans PDB-F2的渗透保护第31-37页
    3.1 引言第31页
    3.2 材料与方法第31-32页
        3.2.1 甜菜碱提取与核磁共振(NMR)分析方法第31-32页
        3.2.2 不同浓度的外源甜菜碱对PDB-F2生长的影响实验第32页
        3.2.3 不同盐度下外源甜菜碱对PDB-F2生长的影响实验第32页
    3.3 结果与讨论第32-36页
        3.3.1 高盐条件下V.halodenitrificans PDB-F2中相容性溶质的积累第32-34页
        3.3.2 不同浓度的外源甜菜碱对V.halodenitrificans PDB-F2生长的影响第34-35页
        3.3.3 外源甜菜碱对V.halodenitrificans PDB-F2耐盐性的影响第35-36页
    3.4 本章小结第36-37页
第4章 甜菜碱转运基因的功能验证及分析第37-58页
    4.1 引言第37-38页
    4.2 材料与方法第38-45页
        4.2.1 菌株、质粒与引物第38-39页
        4.2.2 转运基因对E. coli MKH13的功能互补第39-44页
        4.2.3 功能互补验证第44页
        4.2.4 ~1H-NMR检测相容性溶质第44页
        4.2.5 测定BetL、OpuD1、OpuD2、OpuD3对甜菜碱的亲和力第44-45页
    4.3 结果与讨论第45-56页
        4.3.1 转运基因的PCR扩增与编码产物的特性分析第45-51页
        4.3.2 重组质粒连接转化的PCR验证第51-52页
        4.3.3 功能互补实验第52-53页
        4.3.4 甜菜碱在E.coli MKH13中的积累第53-55页
        4.3.5 BetL、OpuD1、OpuD2、OpuD3对甜菜碱的亲和力第55-56页
    4.4 本章小结第56-58页
第5章 甜菜碱转运基因的渗透胁迫反应第58-71页
    5.1 引言第58页
    5.2 材料与方法第58-62页
        5.2.1 盐度对V.halodenitrificans PDB-F2转运甜菜碱的影响第58-59页
        5.2.2 甜菜碱和NaCl对V. halodenitrificans PDB-F2转运基因的影响第59页
        5.2.3 不同相容性溶质对V.halodenitrificans PDB-F2转运基因的影响第59页
        5.2.4 渗透胁迫对转运过程的控制水平第59页
        5.2.5 生长时期对V.halodenitrificans PDB-F2转运甜菜碱的影响第59页
        5.2.6 总RNA提取与实时荧光定量PCR第59-62页
    5.3 结果与讨论第62-69页
        5.3.1 生长时期对V.halodenitrificans PDB-F2转运甜菜碱的影响第62-64页
        5.3.2 盐度对V.halodenitrificans PDB-F2转运甜菜碱的影响第64-66页
        5.3.3 盐度诱导转运基因betL、opuD1、opuD2和opuD3的转录第66-67页
        5.3.4 转运基因对甜菜碱的转录特异性第67-68页
        5.3.5 V.halodenitrifican PDB-F2中甜菜碱转运过程的控制水平第68-69页
    5.4 本章小结第69-71页
第6章 结论与展望第71-73页
    6.1 结论第71-72页
    6.2 展望第72-73页
参考文献第73-81页
致谢第81-82页
硕士期间相关研究成果第82页
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