阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种多因素引起的,与年龄高度相关,以进行性认知障碍和记忆力损伤为主的中枢神经系统退行性疾病,是最常见的痴呆类型之一。老龄人口中65岁后约13%,85岁后约45%的人患有AD。AD特征性病理改变包括:(1)由39-43个氨基酸组成的β淀粉样蛋白(amyloidβpeptide,Aβ)沉积形成的神经细胞外老年斑(senile plaque,SP);(2)tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT);(3)神经元丢失伴胶质细胞增生。神经细胞凋亡是其主要病理基础之一。高脂血症是AD等神经退行性疾病发生的高危因素,但是高脂血症与神经退行性疾病发生的机制并未完全阐明。本课题旨在研究脂质对神经细胞凋亡的影响及其机制,进而探索高脂血症导致AD等神经退行性疾病发生的机制。第一部分:Ox-LDL对PC12细胞脂质蓄积、凋亡和分泌Aβ的影响以及对PC12细胞中SREBP2、PCSK9及LRP1表达的影响。目的:观察Ox-LDL能否通过调节SREBP2,PCSK9,LRP1表达影响PC12神经细胞凋亡。实验方法:用含10%胎牛血清的高糖培养液培养PC12细胞,待培养瓶中的细胞密度至70%左右时,再换含有不同浓度(0mg/l、25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l)Ox-LDL的新鲜无血清培养液培养PC12细胞24h,用油红O染色检测PC12细胞脂质蓄积;用Hoechst33258染色,流式细胞计数检测细胞凋亡率;用ELISA检测PC12分泌的Aβ;用Western blot检测SREBP2,PCSK9和LRP1蛋白的表达。用含10%胎牛血清的高糖培养液培养PC12细胞,待培养瓶中的细胞生长至70%左右时,亦用75mg/l Ox-LDL处理PC12细胞不同时间(0、6h、12h、24h、48h),用Western blot检测SREBP2,PCSK9和LRP1蛋白的表达。结果:油红O染色检测发现,脂质蓄积呈浓度依赖性增加,75mg/L Ox-LDL组脂质增加最明显;Hoechst33258染色和流式细胞术检测发现,PC12细胞凋亡呈浓度依赖性增加,75mg/L Ox-LDL组凋亡增加最明显;Western blot检测发现SREBP2、PCSK9蛋白表达量呈浓度依赖性增加,75mg/L Ox-LDL组蛋白表达量增加最明显,亦呈时间依赖性增加,处理24h组蛋白表达量增加最明显;而LRP1蛋白表达量呈浓度,时间依赖性降低,分别以75mg/L Ox-LDL组,处理24h组下降最明显。ELISA检测发现培养液中Aβ40及Aβ42含量随着Ox-LDL浓度增大,分泌细胞外的Aβ40及Aβ42含量降低,其中以75mg/L Ox-LDL处理组降低最为显著。小结:Ox-LDL可以通过增加神经细胞中SREBP2和PCSK9蛋白的表达以及降低LRP1蛋白的表达来诱导神经细胞凋亡。第二部分:PCSK9调控Ox-LDL诱导PC12细胞凋亡的机制。目的:探讨PCSK9是否可以通过调控Aβ、PI3K/Akt和NF-κB-Bcl-2/Bax-Caspase(9,3)通路抑制Ox-LDL诱导的PC12细胞凋亡。实验方法:筛选有效的PCSK9 si RNA转染入PC12细胞48h后,换成加入75mg/L Ox-LDL无血清的新鲜培养液处理24h,用Hoechst33258染色检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot分别检测PCSK9、LRP1、PI3K、Akt、P-PI3K、P-Akt、NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达量。用ELISA检测PCSK9 si RNA对Ox-LDL处理的PC12细胞分泌Aβ的影响。结果:将筛选出来的PCSK9 si RNA转染细胞48h后,再用含75mg/l的Ox-LDL处理24h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染PCSK9 si RNA组凋亡明显被抑制;Western blot检测发现转染PCSK9si RNA组NF-κB、Bax、Caspase9、Caspase3表达降低,t-PI3K和t-Akt表达含量基本不变,LRP1、Bcl-2、P-PI3K和P-Akt表达含量增多。用ELISA方法检测培养液中Aβ40及Aβ42含量,发现100n M PCSK9 si RNA+75mg/L ox LDL处理组分泌到细胞外的Aβ40及Aβ42含量增加。小结:PCSK9 si RNA部分恢复了75mg/l Ox-LDL引起的LRP1表达的减少,恢复的LRP1一方面通过激活PI3K/Akt通路和抑制Bcl-2/Bax-Caspase(9,3)通路抑制PC12细胞凋亡;另一方面通过增加细胞外Aβ分泌含量促进PC12细胞凋亡。结论:Ox-LDL通过诱导PCSK9表达增加,降解LRP1,进而影响下游的不同信号途径,在Ox-LDL诱导神经细胞凋亡中发挥双向调节作用:1.抑制PI3K/Akt通路的激活,抑制PC12细胞存活;2.激活NF-κB-Bcl-2/Bax-Caspase(3,9)通路,促进PC12细胞凋亡;3.降低Aβ分泌,有可能抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡。
