结核病,是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起并经呼吸道传播的一种慢性传染病,严重的危害人类健康。病原菌主要侵入人体的肺部,以肺结核病(pulmonary tuberculosis,PTB)最为常见。近年来,由于人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)流行、药物的滥用导致MTB耐药的出现,再加上人们对结核菌并没有引起足够重视,使得世界范围内的结核病又死灰复燃。尽管全球通过扩展直接观察与短程治疗战略及投入大量的资金来提高结核病治疗的完成率,但低下的疾病病例检出率仍然是结核病控制的主要障碍,导致结核病成为发病率和死亡率最高的感染性疾病之一。提高病人的检出率并及时治疗病人是有效控制结核病传染源,遏制结核病流行的最重要措施。目前临床上结核病的诊断方法有多种,都由于各种原因都无法满足临床上辅助诊断与指导用药的需要,因此,迫切需要发现新的标志物应用于发现病人和结核病的有效防控。血清中的蛋白具有非常重要的生理功能,主要包括参与人类机体的代谢、免疫、运输、物质交换、信号调节、凝血作用。在病理状态下血清中低丰度蛋白质的组成和数量通常会发生变化,因此这些具有重要生物学功能的表达量很低的蛋白质对于疾病的监测和诊断有着重要的意义。为了发现结核病的血液标志物,首先需要确定结核病人特别是肺结核病病人是否存在血液标志物,因此,本研究第一部分针对近年来结核的易感标志物研究进行系统的文献分析。研究发现,结核的遗传易感性是由多基因所决定的,其中有关人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)等位基因多态性与结核病易感性的相关性备受关注。因此,通过对现有文献的分析从基因水平上确认在血液中可以找到与结核病相关的易感性标志物。基因是遗传信息的携带者,而生命活动的执行者却是蛋白质,与易感性基因标志物相比,蛋白质标志物可能与结核病的相关性更大。相对和绝对定量的同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)标记的基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)作为新学科及蛋白组学研究技术平台,为发现肺结核病的血清标志物提供了新思路,蛋白质组学及其相关技术让人类能够熟知细胞和生命有机体在特定时间和空间内所表达的全部蛋白质。因此,本研究的第二和第三部分利用相对定量的蛋白组学技术发现和验证血清蛋白性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin,SHBG)、微管蛋白α-3E链(Tubulin alpha-3E chain,TBA3E)分别作为肺结核病和耐多药肺结核病的有价值的候选标志物。第一部分结核病易感标志物的关联性分析目的:采用Meta分析的方法对国内外已发表的有关于HLADRB1、HLA-DQ基因多态性与结核病易感性的文献进行综合分析,寻找结核病相关的易感基因。方法:在Pub Med和EMBASE中,应用关键词‘‘Mycobacterium tuberculosis’’、‘‘tuberculosis’’、‘‘MTB”或‘‘TB”、‘‘HLA-DRB1’’、‘‘HLADQA1’’或‘‘HLA-DQB1’’或‘‘human leukocyte antigen’’或‘‘HLA antigen’’、‘‘Polymorphism”、‘‘Polymorphisms”、或‘‘Genetic polymorphism”搜索1980年1月到2014年6月期间发表的相关英文文献。应用Stata版本11.2软件包对纳入的研究结果进行数据分析。结果:最终分别有21篇和12篇关于HLA-DRB1基因和HLA-DQ基因多态性与结核病易感性的关系的文献符合标准并纳入研究。研究结果表明HLA-DRB1*15、DRB1*08:03和DQB1*0601等位基因多态性增加结核病风险(DRB1*15:OR=1.49,95%CI:1.13-1.97,P=0.005;DRB1*08:03:OR=1.90,95%CI:1.25-2.90,P=0.003),而HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*11、DRB1*11:03和DRB1*12:02等位基因多态性降低结核病风险(DRB1*03:OR=0.82,95%CI:0.68-0.99,P=0.049;DRB1*11:OR=0.71,95%CI:0.54-0.93,P=0.013;DRB1*11:03:OR=0.3,95%CI:0.1-0.4,P=0.028;DRB1*12:02::OR=0.62,95%CI:0.39-0.98,P=0.043)。亚组分析结果表明DRB1*03和DRB1*07:01等位基因多态性会降低亚洲人群结核病的发病风险(DRB1*15:OR=0.78,95%CI:0.62-0.99,P=0.037;DRB1*07:01:OR=0.71,95%CI:0.53-0.95,P=0.020),而DRB1*15、DRB1*08:03和DQB1*0601等位基因多态性增加亚组人群结核病的发病风险(DRB1*15:OR=1.80,95%CI:1.48-2.20,P=0.000;DRB1*08:03:OR=1.91,95%CI:1.25-2.92,P=0.003)。HLA-DQA1等位基因多态性与结核发病风险无明显的关联。结论:HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因多态性与结核病强相关,可能是其易感标志物。HLA-DQA1等位基因多态性与结核发病风险无明显的关联。第二部分基于i TRAQ标记结合MALDI-TOF-MS技术发现肺结核病血清潜在标志物目的:应用相对定量蛋白组学技术筛选肺结核病与对照组血清中的差异表达蛋白并验证潜在标志物,为肺结核病防控提供有价值的血清候选标志物。方法:采用相对和绝对定量的稳定同位素(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)标记结合MALDI-TOF-MS技术分析五组样本的血清蛋白组,即7例耐多药肺结核病(multi-drug resistant pulmonary tuberculosis,MDR-PTB)、30例涂阴肺结核病(smear-negative pulmonary tuberculosis,SNP-TB)、10例涂阳肺结核病(smear-positive pulmonary tuberculosis,SPP-TB)、30例健康对照和10例肺炎血清差异表达蛋白;生物信息学分析差异蛋白的功能;对潜在标志物SHBG蛋白表达水平进行系列验证,包括应用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)验证40例肺结核病和10例对照组织,ELISA验证24例健康对照、35例耐多药肺结核病、55例涂阳肺结核病、70例涂阴肺结核病和15例肺炎的血清标本,Western Blot验证30例健康对照、7例耐多药肺结核病、10例涂阳肺结核病、30例涂阴肺结核病和10例肺炎的血清标本。根据ELISA的结果绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)并分析相关指标。研究结果:相对定量蛋白组学共鉴定和筛选出肺结核病血清26个差异表达蛋白(包括16个蛋白上调表达和10个蛋白下调表达)。ELISA方法分析发现SHBG蛋白在肺结核病中表达水平增高(耐多药肺结核病组:181.76±200.09 nmol/L、涂阳肺结核病组:160.43±75.45 nmol/L、涂阴肺结核病组:159.75±75.47 nmol/L、肺炎组:60.63±59.38 nmol/L、健康对照组:33.39±34.24 nmol/L;p<0.0001),IHC和Western Blot方法的验证结果也表明SHBG蛋白在肺结核病中表达水平增高(p<0.05),三种验证方法的表达趋势与蛋白组学筛选的结果完全一致。ROC曲线分析发现SHBG蛋白鉴别肺结核病与肺炎、健康对照的准确性、灵敏性、特异性和AUC分别为78.74%、75.6%、91.53%和0.981。结论:建立蛋白组学筛选和鉴定肺结核病血清差异表达蛋白的技术平台;血清SHBG蛋白鉴别肺结核病与肺炎、健康对照的具有较高准确性、灵敏度和特异度;是肺结核病防控有价值的血清候选标志物。第三部分基于i TRAQ标记结合MALDI-TOF-MS技术发现耐多药肺结核病血清潜在标志物目的:应用相对定量蛋白组学技术筛选耐多药肺结核病与对照血清中的差异表达蛋白,进一步应用ELISA和质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)技术验证潜在的标志物。方法:采用i TRAQ标记结合MALDI-TOF-MS技术分析四组血清样本的蛋白,包括7例耐多药肺结核病、30例涂阴肺结核病、30例健康对照组和10例肺炎组,并通过Proteinpilot软件筛选与鉴定耐多药肺结核病相关的差异蛋白;应用生物信息学分析显著差异蛋白的细胞成分、分子功能和生物过程;对潜在标志物TBA3E、纤连蛋白(Fibronectin 1,FN1)和玻连蛋白(Vitronectin,VTN)的表达水平进行验证,ELISA验证19例健康对照、15例肺炎、22例涂阴肺结核病和13例耐多药肺结核病血清标本中TBA3E蛋白表达水平;以及26例健康对照、26例肺炎、25例涂阴肺结核病和27例耐多药肺结核病血清标本中VTN表达水平;MRM技术验证蛋白VTN和FN1在10例健康对照、10例肺炎、10例涂阴肺结核病和10例耐多药肺结核病血清标本表达水平。绘制ROC曲线并分析相关指标。结果:比较涂阴肺结核病、健康对照、肺炎血清蛋白组,在耐多药肺结核病血清中共鉴定和筛选出17个差异表达蛋白(包括9个蛋白上调表达和8个蛋白下调表达)。经ELISA方法分析发现TBA3E蛋白在耐多药肺结核病中表达水平增高(耐多药肺结核病组:311.31±161.73μg/ml、涂阴肺结核病组:6.17±6.29μg/ml、肺炎组:6.38±7.72μg/ml、健康对照组:53.73±20.05μg/ml;p<0.0001),表达趋势与i TRAQ的结果完全一致。ROC曲线分析发现TBA3E蛋白鉴别耐多药肺结核病与肺炎、健康对照、涂阴肺结核病的准确性、灵敏性、特异性和AUC为91.07%、84.6%、94.6%和0.949。经MRM分析发现蛋白FN1和VTN在耐多药肺结核病中表达水平降低,表达趋势与蛋白组学筛选的结果完全一致,但VTN蛋白的ELISA结果与蛋白组学筛选的结果不一致。结论:TBA3E蛋白鉴别耐多药肺结核病与涂阴肺结核病、肺炎、健康对照的具有较高的准确性、灵敏度和特异度;可能是耐多药肺结核病候选的血清标志物;FN1蛋白和VTN蛋白是否是耐多药肺结核病的潜在生物学标志物需要进一步研究。
