嗜麦芽黄单胞菌CG样受体及xCG蛋白的基因研究--嗜麦芽黄单胞菌CG样受体跨膜域的克隆，基因组文库的构建筛选及xCG蛋白的基因多型性分析

嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia ATCC13637)属于G~-，既具有类似哺乳动物调节妊娠与生殖的LH/CG(黄体生成素/绒毛膜促性腺激素)受体的CG类受体蛋白(CG-like receptor)，又能分泌分子量为48.5 KD、与hCG分子β链有一定同源性的xCG蛋白。X maltophilia是第一个发现既具有内源性配基(xCG蛋白)，又具有受体(CG样受体)的原核生物。 X maltophilia CG样受体在蛋白质分子量、配基结合特性等方面与大鼠LH/CG受体有一定的相似性，至今对该菌CG样受体的基因、结构与功能均不清楚。为了进一步了解嗜麦芽黄单胞菌CG样受体的生物学功能，深入研究其结构，需从分子水平研究编码CG样受体的基因及其结构特点，并与哺乳类LH/CG受体基因及其蛋白序列进行比对分析。这对于探讨原核生物CG样受体与真核生物LH/CG受体是否存在共源性，以及该菌的致病机制均有重要意义。博创卜学位论文摘要 首先，鉴定确证菌种xmalt叩hsliaATCC13637属于嗜麦芽黄单胞菌;并建立了一种快速简便提取嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA的方法，即用去污剂SDS和CTAB破坏细胞膜结构，使胞内核酸释放，用酚/氯仿/异戊醇去除CTAB/多聚糖/蛋白质复合物，异丙醇沉淀DNA，TE溶解DNA。该方法简便快速，节省实验试剂和时间;所提取的DNA纯度和浓度均较好，为进一步酶切分析、PCR操作及构建基因组文库提供了良好的实验材料。 其次，根据已知生物LH/CG受体同源性较大的跨膜域序列设计了一对引物，以嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA为模板进行pCR扩增，约600 bp目的pCR产物克隆到pUCm一T载体上，经酶切及PCR扩增鉴定，获得重组质粒pUCm一Re。。以D工G标记的PCR扩增片段作为探针进行DNA斑点杂交，探针与肠al消化的重组质粒(pUCm一Rec)DNA和嗜麦芽黄单胞菌染色体DNA有阳性杂交信号，说明约600 bpPCR扩增片段与嗜麦芽黄单胞菌染色体DNA有同源性，是以嗜麦芽黄单胞菌染色体DNA为模板的扩增结果。重组质粒pUCm一Rec测序分析表明，593bp CG样受体跨膜域的核酸序列及其推定编码的197aa序列，分别与哺乳类LH/CG受体跨膜域相应区域的碱基序列和氨基酸序列无同源性。推定编码197 aa跨膜域序列的5一196aa部分与新月柄杆菌CB15 572aa功能未知的推定蛋白的199一388aa序列具有51%相同序列;其16~76aa部分与线虫鸟昔酸环化酶的985~1 O46aa部分具有33%相同 博d匕学位论文摘要序列，提示嗜麦芽黄单胞菌可能具有类似鸟普酸环化酶/c GMP信号系统，为进一步研究其信号转导机制提供线索。 第三，自行构建了嗜麦芽黄单胞菌基因组文库，并对文库进行了筛选。嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA分别用Sau3AI和尸stl进行不完全酶解后，凝胶电泳分别回收纯化1~skb和0.5~7kb DNA片段;分别用Ba麒I和Pstl消化载体pUC18后进行去磷酸化处理，再分别与DNA/Sau3AI和DNA/尸stl回收片段连接，转化感受态JM109，各得到4200个左右白色转化子，转化平板上白色菌落与蓝色菌落之比约为7:3。从DNA/万au3AI+pUC18/Ba刃Hl和DNA/Pstl+pUC18/Ps才I转化平板上各挑出约2000个白色菌落于NC膜上，以地高辛标记的跨膜域序列为探针进行菌落杂交，初步得到20个阳性杂交信号的菌落。 对阳性信号菌落的质粒进行尸s亡I酶切鉴定后，对杂交信号强的4个菌落的质粒进行测序分析，未获得嗜麦芽黄单胞菌CG样受体的全基因序列。但是，685bp克隆片段与编码组氨酸激酶/反应调节子杂合蛋白的野油菜黄单胞菌XCC2846基因和柑桔黄单胞菌XAC3O30基因部分序列有较大的相似性和同源性，表明在嗜麦芽黄单胞菌中存在着编码组氨酸激酶/反应调节子杂合蛋白的基因和功能蛋白。另一375bp片段编码125aa完整ORF与柑桔黄单胞菌铁受体蛋白部分序列有32%相同氨基酸残基，表明嗜麦芽黄单胞菌可能具有编码类似铁受体蛋白的基因和功能蛋白质。为淦释嗜麦博d二学位论文摘要芽黄单胞菌的基因功能，深入了解该菌的遗传、进化和生物学地位提供了实验依据。 越来越多的研究表明，LH/CG受体及其配基均具有异质性。因此，我们还对X。。Jtop力jJ丁a配基xCG蛋白的基因多型性进行了研究。根据嗜麦芽黄单胞菌xCG蛋白相对保守的91~193aa残基域的核酸序列设计了一对引物，以X二al亡。ph丁了1’a基因组DNA为模板，PCR扩增得到约500bp和25obp的两条带。将PcR产物克隆入pUCm一T载体，筛选鉴定后得到重组质粒pCGZ和pCGll。对重组质粒pCGZ和pCGll测序分析表明，472bp和224bp插入片段及其推定编码的氨基酸序列与xCG蛋白保守区域的核酸序列和氨基酸序列均有异，提示编码嗜麦芽黄单胞菌xCG蛋白的基因具有多型性。为进一步研究X。刁了toP力了lj日CG样受体与CG样蛋白的结构与功能、及LH/CG受体基因和hCG基因的进化提供线索。