第一部分子宫颈病变组织血管生成情况及血管密度的分析目的：检测VEGF在正常对照、子宫颈上皮内瘤变(CIN)和子宫颈癌(CC)组织切片中的表达情况,并结合微血管密度(MVD),比较不同程度子宫颈病变VEGF蛋白表达差异及其与微血管密度的相关性;方法：40例不同程度子宫颈病变患者作为研究组,10例正常宫颈的妇女作为对照组。用免疫组化的方法检测VEGF蛋白的表达情况及其与微血管密度的关系。结果：1正常对照、CINⅠ-Ⅲ和宫颈癌的微血管密度分别为22.74±6.34、24.57±3.48、32.66±4.16、43.55±6.31、60.01±12.29。其中CINⅠ与正常对照MVD相比无明显差异。正常对照组、CINⅠ与CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌组均有显著差异(P<0.05),CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌组之间亦具有显著差异(P<0.05)。微血管密度随子宫颈病变程度的加重而增加,从正常对照到宫颈癌MVD有逐渐升高的趋势。2不同程度子宫颈病变及正常对照中均可检测到VEGF蛋白的免疫染色。正常对照中为VEGF弱阳性染色,子宫颈病变VEGF的表达多为强阳性,并随组织学分级程度加重而增强。在CINⅡ、Ⅲ及宫颈癌的VEGF染色与正常对照和CINⅠ相比,差异有显著性(P<0.05)。结论：1从正常对照组到宫颈癌组的MVD有逐渐升高的趋势。说明血管形成在宫颈病变中存在,且在CIN发展至宫颈癌的过程中有重要作用。2 VEGF蛋白的表达随子宫颈病变程度升高而逐渐升高。3 VEGF表达和MVD明显相关。表明VEGF与子宫颈病变的血管形成程度密切相关。第二部分rAAV-Endostatin治疗人宫颈癌荷瘤裸鼠的体内试验研究目的：建立人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤模型,观察移植瘤新生血管生成情况并探讨rAAV-Es在移植瘤治疗中的作用。方法：将Hela单细胞悬液(5×106/m1)接种在裸鼠左腋皮下,1周后观察其生长情况,出现2-3mm大小皮下移植瘤后开始治疗实验,随机将荷瘤裸鼠分为3组,每组10只,在裸鼠移植瘤瘤内及瘤周注射PBS、rAAV、rAAV-Es各0.1ml,4周后处死裸鼠提取标本。采用免疫组化S-P法检测移植瘤内微血管密度(MVD, CD31标记),Elisa方法检测裸鼠血清中Endostatin及VEGF的浓度。HE染色观察裸鼠心、肺、肝、’肾等组织的变化。结果：30只裸鼠均接种成功,成功建立宫颈癌Hela裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。移植瘤周边及中心可见血管生成明显。rAAV-Es组瘤块体积、瘤重均低于PBS组、rAAV组(P<0.05),而裸鼠体重各组间无明显差异。内皮细胞CD31表达阳性,三组MVD分别为24.09±3.12、22.71±4.04、13.60±4.68,rAAV-Es组MVD低于PBS组、rAAV组,差异具有统计学意义(P<0.05)；Elisa检测裸鼠血清中Endostatin浓度三组分别为133.78±13.09 ng/ml、130.31±9.96 ng/ml、204.64±25.97 ng/ml, rAAV-Es组高于两对照组,差异有统计学意义；VEGF浓度三组分别为264.28±49.82 ng/ml、282.36±37.18 ng/ml、193.03±28.46ng/ml, rAAV-Es组低于两对照组,差异有统计学意义。光镜下观察裸鼠心、肝、肺、肾等组织未见缺血改变。结论：采用裸鼠皮下接种Hela细胞成功建立宫颈癌裸鼠模型,可见到移植瘤表面血管生成明显；rAAV-Es基因治疗安全可靠,在裸鼠血中可以长期稳定表达内皮抑素蛋白,抑制VEGF的表达,并对移植瘤产生抑制作用；对心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺脏未造成明显的形态学改变。该基因治疗方法是安全的。第三部分rAAV-Endostatin治疗人宫颈癌种植瘤的比较研究目的：研究rAAV-Es单独及联合顺铂治疗宫颈癌裸鼠移植瘤模型的有效性和安全性,初步探讨可能的作用机制。方法：对Hela细胞宫颈癌的荷瘤裸鼠进行rAAV-Es单独及联合顺铂治疗并与对照组及单用顺铂进行对比,观察肿瘤生长情况。免疫组化法检测移植瘤内VEGF、KDR、MMP-2和微血管密度(MVD)的表达；Elisa法检测治疗后裸鼠血清内Endostatin、VEGF的表达情况；原位杂交法检测移植瘤内PI3K信号通路的表达情况,并作统计学分析。结果：1单用rAAV-Es/顺铂及联合处理组对裸鼠Hela宫颈癌移植瘤的生长均有明显的抑制作用,与PBS、空载体对照组之间的差异有统计学意义(p<0.05),且联合治疗组的抑瘤作用最为明确。2 rAAV-Es组、rAAV-Es+顺铂组及顺铂组移植瘤中VEGF、KDR、MMP-2的表达水平下降,与PBS组、空载体对照组相比具有统计学意义(p<0.05)；在下降的三组中,联合治疗组三种蛋白的表达下降最明显,与其余两个单药治疗组相比有统计学意义,而rAAV-Es组与顺铂组治疗差异无统计学意义。VEGF及其受体KDR表达下降呈同步趋势。3 rAAV-Es组、rAAV-Es+顺铂组及顺铂组移植瘤内血管生成被显著抑制,rAAV-Es+顺铂组肿瘤MVD最小,组间差异具有统计学意义。4应用rAAV-Es的组别裸鼠血清中Endostatin分泌增加(p<0.05),而顺铂组与对照组之间无差异结论(p>0.05)：rAAV-Es组、rAAV-Es+顺铂组及顺铂组VEGF分泌下降,而应用rAAV-Es的组别VEGF分泌下降较顺铂组更为明显(p<0.05)；5 rAAV-Es组、rAAV-Es+顺铂组及顺铂组中PI3K的表达下降,与对照组相比具有统计学意义；而这三组中联合治疗组PI3K表达下降最为明显,与rAAV-Es组及顺铂组相比具有统计学意义。结论:rAAV-Es、rAAV-Es+顺铂联合应用对宫颈癌Hela细胞裸鼠移植肿瘤生长有明显抑制作用,并减少顺铂化疗的副作用,其作用机制可能与抑制血管生成因子及其受体表达、减少基底膜降解及抑制PI3K/AKT细胞信号通路有关。内皮抑素通过以上机制诱导血管内皮细胞凋亡,使肿瘤细胞缺乏营养从而促癌细胞凋亡,并抑制肿瘤细胞的转移达到抗肿瘤的作用。抗血管生成治疗与化疗药物顺铂联合后抗肿瘤的效果得到加强且副作用小,有望成为临床治疗宫颈癌的一个新途径。
