背景和目的食管癌是最常见的消化道疾病之一,其死亡率几乎与胃癌相当,治疗效果较差,5年存活率还不足10%,严重威胁着人类健康。食管癌分为食管鳞癌和食管腺癌,我国以食管鳞癌居多,食管腺癌较少,尤其是河南安阳、林州等地是食管癌的高发地区。目前食管癌还没有特效治疗药物,而且其治疗方案的选择也与发病时期有关,处于发病早期和部分中期的患者可以采用手术治疗,而晚期患者只能采用放化疗方案,并且效果都不是特别理想。毛叶香茶菜是唇形科植物,主要含有二萜、三萜、木质素和黄酮类等化合物,已有体内外研究表明,毛叶香茶菜素A、G和E在体外对艾氏腹水癌(ECA)的增殖具有明显的抑制作用,在体内同样表现出一定的抗肿瘤效应,毛叶香茶菜素B对L1210白血病小鼠模型的生命延长表现出可观的效果,毛叶香茶菜素C和D则没有抗肿瘤作用。目前对毛叶香茶菜素F的研究较少,关于其对食管癌的作用文献中尚未见报道,本研的目的在于初步探讨毛叶香茶菜素F对人食管癌EC9706细胞增殖的抑制作用及机制。材料和方法1.MTT法粗测样品活性以食管癌EC9706细胞为模型,试验组分别加100、80、50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品,阴性对照组加相同体积的完全培养基,在37℃5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后每孔加20μl MTT溶液,继续培养4h后吸掉上清并每孔加入160μl DMSO,用酶标仪检测吸光度。2.观察样品对细胞生长状态的影响试验组分别加入80、50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品,阴性对照组加相同体积的完全培养基,在37℃5%的CO2培养箱中培养72h后在显微镜下观察细胞生长状态并拍照。3.细胞划痕试验阴性对照组不加药,试验组分别加入50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品,阳性对照组加入50μg/ml顺铂,作用24h后,在显微镜下观察、取样、拍照并测量各划痕区域的面积。4.Hoechst/PI细胞凋亡检测试验组分别加入80、50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品,阴性对照组加相同体积的完全培养基,在37℃5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后加入荧光染料,然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.细胞周期检测试验组分别加入50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品,阴性对照组加相同体积的完全培养基,在37℃5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后加入荧光染料,然后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。6.Western blot检测样品对EC9706细胞中5种蛋白表达的影响试验组按照50、40、30μg/ml的浓度加入毛叶香茶菜素F样品,阴性对照组加相同体积的完全培养基,在37℃5%的CO2培养箱中分别培养72h后,提取相关蛋白,用Western blot方法检测毛叶香茶菜素F作用后Bax、Bcl-2、Caspase-3、m TOR及P53五种蛋白表达水平的变化。7.SPSS统计学处理采用统计学处理软件SPSS17.0,数据资料采用x±s的表示形式,每组试验均重复三次以上。结果1.MTT法检测结果显示,毛叶香茶菜素F作用24h、48h和72h后对EC9706细胞的生长均表现出明显的抑制作用,其IC50分别为46.7μg/ml、25.4μg/ml和20.6μg/ml,且随着浓度的增大和时间的延长抑制作用也呈增强的趋势。2.试验组在不同浓度的毛叶香茶菜素F样品作用72h后与对照组相比,细胞体积变小,细胞质皱缩,呈较小的颗粒状。3.在细胞划痕试验中,毛叶香茶菜素F终浓度为50μg/ml组细胞培养24h后划痕面积约为3.10×105,与对照组2.52×105相比明显增大,并且差异具有统计学意义(P<0.05)。4.当浓度为50μg/ml时,毛叶香茶菜素F作用24h、48h和72h后细胞凋亡率约分别为20.20%、21.65%和53.21%,当作用时间为72h,随着浓度的增大细胞凋亡率分别为10.37%、17.84%、53.21%和86.63%,;当浓度为50μg/ml时,毛叶香茶菜素F作用24h、48h和72h后细胞周期G1期细胞比例分别为58.53%、57.37%和52.37%,S期细胞比例分别为40.06%、41.16%和45.62%,当作用时间为72h,随着浓度的增大G1期细胞比例分别为59.65%、56.43%和52.37%,S期细胞比例分别为39.71%、42.35%和45.62%,均呈时间和浓度依赖性,且组间差异具有统计学意义(P<0.05),G2期细胞无明显变化。5.毛叶香茶菜素F对EC9706细胞5种蛋白表达水平的影响毛叶香茶菜素F作用72h后,随着浓度的增大,Bax蛋白灰度值分别为0.91、1.20和1.26、Caspase-3蛋白灰度值分别为0.77、0.83和1.11,而Bcl-2蛋白灰度值分别为1.01、0.95和0.92,m TOR蛋白灰度值分别为1.08、0.84和0.71,P53(突变型)蛋白的灰度值分别为0.94、0.72和0.58,与对照组相比发现其可以上调Bax和Caspase-3蛋白的表达、下调Bcl-2、m TOR及P53(突变型)蛋白的表达。结论毛叶香茶菜素F可以上调Bax、Caspase-3蛋白的表达水平,下调Bcl-2、m TOR及P53(突变型)蛋白的表达水平,能够抑制食管癌EC9706细胞的增殖、迁移,将细胞生长阻滞于S期,促进细胞的凋亡,这些可能是毛叶香茶菜素F产生抗肿瘤作用的机制之一。
