草鱼Mx2和MDA5基因多态性与草鱼出血病抗性的关联研究

草鱼具有生长快、养殖成本低、肉质好等优点，现已成为我国重要的淡水养殖经济鱼类之一，养殖规模占据“四大家鱼”之首。由于草鱼自身抗病能力较弱，每年因病害对水产养殖业造成的损失巨大。其中由草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）所引起的草鱼出血病已成为草鱼养殖中出现的主要流行病之一。多年来，水产工作者一直在寻找针对该疾病的预防和治疗方法，但直至目前尚未得到理想结果。从先天免疫途径入手，在与抗病毒相关的免疫基因中寻找相关多态性位点，或许能为草鱼抗病选种提供分子标记，为疾病的防控提供新的思路。Mx基因是一类重要的干扰素激活基因，在干扰素诱导下表达，并发挥抗病毒效应，是先天免疫效应分子中的研究热点。MDA5基因是RLR家族成员之一，能识别双链RNA病毒，在抗病毒反应过程中发挥重要作用。因此开展这两个基因与抗病的关联性研究具有重要意义。(1) CiMx2基因多态性与草鱼出血病抗性的关联研究根据NCBI中已有草鱼Mx基因（AY395698）cDNA序列和斑马鱼Mxe基因（ENSDARG00000014427）基因组序列，经过序列比对预测草鱼Mx基因内含子插入位置及大小。在草鱼Mx cDNA上分段设计引物，以草鱼gDNA为模板，分段扩出并拼接得到草鱼Mx2基因全序列。草鱼Mx2全长8108bp，包含12个外显子和11个内含子。比较已知的不同鱼类Mx基因组序列，发现鱼类Mx基因结构相对保守，均含有12个外显子。通过对草鱼Mx2基因测序、峰图分析、序列比对，确定了五个单核苷酸多态位点，主要分布于内含子里。统计结果表明第二内含子中1191C/A和1205G/A位点的基因型频率在抗性组和易感组之间差异显著(P <0.05)。在验证实验中，1191CC和1205GA基因型个体的死亡率显著低于其他基因型个体的死亡率，进一步证实了1191C/A和1205G/A位点与草鱼出血病抗性相关(P <0.05)。统计结果还发现7C/T和528C/T之间存在连锁不平衡，对其进行单体型分析后发现所有单体型均与草鱼出血病的抗性或易感性无关。(2) CiMDA5基因与草鱼出血病抗性的关联研究本研究确定草鱼MDA5基因全长10906bp，包含7个外显子和6个内含子，比较发现不同物种MDA5基因的长度及结构差异较大。利用基因组步移技术克隆得到938bp5’侧翼序列，在线软件分析预测该段序列之中包含CdxA，HSF，Oct-1，SBF-1，SRY，Dfd，AP-1，c-Ets-等多个转录因子结合位点。5’侧翼序列连接至启动子已被切除的载体，新构建的载体转染草鱼CIK细胞，证实此片段具有启动活性。通过对草鱼MDA5基因测序、峰图分析、序列比对，确定六个单核苷酸多态位点，其中五个位点分布于内含子里，一个位于5’侧翼序列。统计结果表明-713G/C和3338A/C位点的等位基因频率在抗性组和易感组之间差异显著(P <0.05)。-713G/C位点在5’侧翼序列中，仅当-713G时该位点所在区域内出现c-Ets-转录因子结合位点，当-713C时则无转录因子结合位点，这或许是-713G/C位点与抗草鱼出血病相关的原因之一。以上试验结果显示CiMx2基因中1191C/A、1205G/A单核苷酸多态位点以及CiMDA5基因中的-713G/C、3338A/C位点与抗草鱼出血病相关，此研究结果丰富了草鱼抗病育种的候选基因和分子标记，为草鱼抗病育种奠定了前期基础。