雌激素对P2X3受体介导的外周痛觉信号转导的快速抑制作用

【研究目的】疼痛是人体各部分受到损伤性刺激引起的不愉快的感觉，它提供躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能。但另一方面，严重的慢性疼痛困扰着数以百万计的人们，是临床的一大难题。因而了解疼痛产生的机制，寻找解除疼痛的方法，是医学领域亟待解决的问题。临床观察早就注意到疼痛有明显的性别差异，主要表现在以下几个方面：①肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome， IBS）、间质性膀胱炎（Interstitial Cystitis，IC）、颞下颌关节炎等病症多见于女性；②这些病症与月经和性激素周期相关[1]。这些证据表明雌激素可能参与痛觉的调节。ATP不仅是一种供能物质，而且还通过与特异的受体结合发挥神经递质的作用。这种特异性ATP受体即为“嘌呤受体”，按激动剂的选择性分为P1和P2两大类。P2受体被分为P2X和P2Y两大类，目前已有7种P2X受体蛋白序列被克隆出来(P2X1-P2X7)。而目前研究的较多的是P2X3受体，它一般在胞浆表达，在胞膜发挥作用，选择性地表达于初级传入感觉神经元如背根神经节、三叉神经节和结状神经节上，且以中、小型神经节细胞为主。P2X3受体可由脊神经节胞体合成后转运到中枢端与外周端，其中枢端轴突末梢投射入脊髓背角的Ⅱ层深部，外周端分布至皮肤、舌体和内脏等器官[2]。运用P2X3受体选择性拮抗剂A-317491、反义寡核苷酸、RNA干扰和基因敲除技术后，痛觉敏感性显著降低，进一步表明ATP和P2X3受体参与并调制多种疼痛信号的传递[3]。在体内，雌激素与其特异性受体结合后发挥生物学作用。经典的雌激素受体（ER）是核受体超家族成员之一，分为α和β两种亚型，他们广泛分布于各种组织，介导雌激素的多种效应。在神经系统中，ERs也有广泛分布。神经解剖学研究显示，ERα和ERβ广泛分布于痛觉传递和调制通路中，如背根神经节、脊髓背角(主要分布在板层Ⅱ，在板层I、III、V和X也有一定程度的分布)、中脑导水管周围灰质、臂旁核、脊核、下丘脑、大脑边缘系统和几个皮质区等区域[4]。由于ERα、β是核受体，雌激素必须穿过细胞膜进入细胞才能发挥生物学效应，所以，作用比较慢。然而，近些年研究发现，雌激素还有快速作用（几分钟内），这表明雌激素可以与细胞膜上某种蛋白结合，进而发挥作用，后来人们发现，细胞膜上存在一种雌激素受体GPR30[5]。也有人发现，雌激素核受体也可以转移到膜上参与完成这种快速作用[6]。因而在本课题中，我们运用动物行为学、全细胞膜片钳等方法，从整体、细胞水平研究雌激素对P2X3受体介导的外周痛觉信号转导的快速调节作用。重点探讨急性炎症条件下雌激素对初级感觉传入神经元（DRG）上P2X3受体的功能影响，对于阐明疼痛的性别相关性，以及将来研制新一代的镇痛剂，具有重要的意义。【研究方法】电生理学实验：急性分离培养小鼠或大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元，通过全细胞膜片钳方法记录P2X3受体介导的瞬时型ATP电流，并给与一定浓度的雌二醇（E2）或相应雌激素受体的激动剂，并且给予相关细胞信号通路酶的抑制剂，观察α,β-me-ATP介导的电流的变化。行为学实验：1、雌二醇（E2）对外周痛觉的抑制作用（1）E2对外周机械痛阈的影响16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分为saline和E2两组，分别在左脚足底皮下注射saline和E2后，以机械刺激（Von Frey filaments）为研究方法，分别于注射后0、10、30、50、70、90min观察两组的缩腿阈值（PWT）的差异。（2）E2对α,β-me-ATP诱导的外周自发痛的影响16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分为saline和E2两组，分别在左脚足底皮下注射saline+α,β-me-ATP和E2+α,β-me-ATP，观察注射后缩腿时间（PWD）的差异。2、ERα及GPR30激活对P2X3受体介导的外周痛觉的抑制作用（1）ERα激活抑制了P2X3受体介导的外周痛觉24只雌性Sprague-Dawley大鼠，分为Ethanol、PPT、DPN三组，分别在左脚足底皮下注射Ethanol+α,β-me-ATP、PPT+α,β-me-ATP和DPN+α,β-me-ATP，观察注射后缩腿时间（PWD）的差异。（2）GPR30激活抑制了P2X3受体介导的外周痛觉16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分为DMSO、G-1两组，分别在左脚足底皮下注射DMSO+α,β-me-ATP、G-1+α,β-me-ATP、观察注射后缩腿时间（PWD）的差异。3、ERK1/2途径参与了雌二醇（E2）对P2X3受体介导的外周痛觉信号转导的快速抑制作用32只雌性Sprague-Dawley大鼠，分为saline、E2、U0126和E2+U0126四组，分别在左脚足底皮下注射saline+α,β-me-ATP、E2+α,β-me-ATP、U0126+α,β-me-ATP和E2+α,β-me-ATP+U0126，观察注射后缩腿时间（PWD）的差异。【结果】电生理学实验：1、在ERα、ERβ受体野生型和基因敲除型鼠分离培养的DRG神经元细胞上，野生型鼠中，雌二醇（E2）可以快速抑制P2X3受体介导的电流；而在ERα受体敲除鼠中，雌二醇（E2）对P2X3受体介导的电流没有明显影响；在ERβ受体敲除鼠中，雌二醇（E2）可以部分抑制P2X3受体介导的电流。2、ERα特异性激动剂PPT、GPR30特异性激动剂G-1均能抑制P2X3受体介导的电流,ERβ特异性激动剂DPN对P2X3受体介导的电流没有明显的影响。GPR30拮抗剂G-15能逆转E2对P2X3受体介导的电流的抑制作用。3、ERK1/2拮抗剂U0126能逆转ERα特异性激动剂PPT、GPR30特异性激动剂G-1对P2X3受体介导的电流的抑制作用。4、另一个ERK1/2拮抗剂PD98059能逆转E2对P2X3受体介导的电流的抑制作用行为学实验：1、弗莱毛（Von Frey filaments）测试显示，在正常雌性大鼠中，saline组和E2组PWT有显著差异，50min后，E2组显著高于saline组，且E2组PWT随时间逐渐降低。2、在α,β-me-ATP诱导的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，saline组和E2组间PWD有显著性差异，E2组低于saline组。3、在α,β-me-ATP诱导的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，Ethanol组、PPT组和DPN组间PWD有显著差异，PPT组低于Ethanol组，但DPN组与Ethanol组没有明显差异，表明了ERα受体激活对P2X3受体介导的外周痛觉的抑制作用。4、在α,β-me-ATP诱导的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，DMSO组和G-1组间PWD有差异显著，G-1组的PWD低于DMSO组，表明了GPR30激活对P2X3受体介导的外周痛觉的抑制作用。5、在α,β-me-ATP诱导的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，saline组、E2组、U0126组和E2+U0126组间PWD有显著差异，U0126组与saline组间无显著差异。E2组显著低于saline组，E2+U0126组显著高于E2组，但E2+U0126组与saline组没有明显差异，提示了U0126能逆转E2对P2X3受体介导的外周痛觉的抑制作用，即ERK1/2途径参与了这种作用。【结论】1、ERα受体敲除后，雌二醇（E2）对P2X3受体介导的电流抑制作用消失；ERβ受体敲除后，雌二醇（E2）对P2X3受体介导的电流仍存在部分抑制作用。2、ERα特异性激动剂PPT快速抑制P2X3受体介导的瞬时电流；ERβ特异性激动剂DPN对P2X3受体介导的瞬时电流没有明显影响。3、GPR30特异性激动剂G-1快速抑制P2X3受体介导的瞬时电流；雌二醇（E2）对P2X3受体介导的瞬时电流的抑制作用可以被GPR30特异拮抗剂G-15阻断。4、ERK1/2抑制剂U0126能阻断PPT、G-1对于P2X3受体介导的电流抑制作用，另一个ERK1/2抑制剂PD98059能阻断雌二醇（E2）对于P2X3受体介导的电流抑制作用。5、雌二醇（E2）、PPT、G-1快速抑制P2X3受体介导的外周痛觉，DPN无明显作用。6、ERK1/2的抑制剂U0126能逆转雌二醇（E2）对P2X3受体介导的外周痛觉的抑制作用。综上所述，雌激素对外周痛觉的调节可能通过作用于初级感觉传入神经元上ERα、GPR30等受体，并影响P2X3受体的功能来实现，且这一调节作用可能包括胞内ERK1/2途径的参与。这些结果不仅进一步证实了雌激素对于外周痛觉的形成具有抑制性调节作用，而且首次发现这种调节作用主要通过ERα和GPR30等受体来介导，这一调节作用在外周痛觉信号转导的水平就已经存在。