Klotho基因多态性、血浆水平与2型糖尿病下肢动脉粥样硬化、骨密度改变的相关性研究

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第一部分ASP-PCR和FQ-PCR方法检测Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性的比较目的探讨Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性准确可靠的实验检测方法。方法运用等位基因特异引物-聚合酶链式反应(allelic specific primer polymerase chain reaction, ASP-PCR)技术及实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)技术检测Klotho基因G-395A、F352V、C370S位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),比较分析两种方法对上述三个SNP位点检测的差异。结果①ASP-PCR方法检测G-395A位点的实验结果不稳定、重复性差;F352V位点未发现V等位基因扩增产物;C370S位点的目的扩增片段不清晰,非特异性扩增产物多。②FQ-PCR方法检测G-395A、F352V、C370S位点的实验结果稳定、重复性好、效果理想、易于判断基因型,测序后基因型结果一致。结论ASP-PCR技术可能不适用于Klotho基因G-395A、F352V、C370S位点的多态性检测,FQ-PCR技术能准确进行这三个位点的多态性分析。第二部分Klotho的三个位点SNP与2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性研究目的探讨Klotho勺3个SNP位点(G-395A,F352V,C370S)基因型与中国昆明地区汉族人2型糖尿病及2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性。方法运用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)技术,分别对237例2型糖尿病(B组)患者[无下肢动脉粥样硬化(B1)组79例,合并下肢动脉粥样硬化(B2)组158例]和85例健康对照者(A组)检测Klotho基因3个SNP位点的基因型,并比较分析各组间基因型频率、等位基因频率及相关临床指标。结果①Klotho基因G-395A多态性,GG、GA及AA基因型频率分别为69.9%(225例)、25.8%(83例)、4.3%(14例),等位基因G和A的频率分别为82.8%和17.2%。②Klotho基因F352V、C370S位点间为完全连锁不平衡,所有样本中未发现突变纯合型(VV、SS型),杂合型(FV、CS型)仅发现2例,其余均为野生型(FF、CC型)。③Klotho基因G-395A多态性在A组和B组中的基因型及等位基因频率无统计学差异(χ2=0.290,P=0.590;χ2=0.229,P=0.633),B2组的GA+AA基因型频率高于B1组(χ2=4.456,P=0.035)。④Klotho基因G-395A的杂合型GA及纯合型AA与2型糖尿病下肢动脉粥样硬化的发生独立相关(OR=3.199,95%CI:0.860-11.893)。结论①在中国昆明地区汉族人中存在Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性,F352V和C370S位点间为完全连锁不平衡,其多态性罕见。②Klotho基因G-395A位点的杂合型GA及突变纯合型AA可能是2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的遗传危险因子。第三部分血浆Klotho水平与2型糖尿病及骨密度改变的相关性研究目的探讨昆明地区汉族人群中血浆中Klotho水平与2型糖尿病(T2DM)及骨密度(BMD)改变的相关性。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA),检测220例2型糖尿病患者(T2DM组)和76例正常对照者(NC组)血浆中Klotho水平,并测定相关临床资料和生化指标,比较组间差异。使用美国GE公司的双能X线骨密度仪对159例T2DM患者进行骨密度测定,根据WH01994年推荐的骨质疏松标准将T2DM患者分为3个组:骨量正常(BMD0)组77例,骨量减少(BMD1)组59例,骨质疏松(OP)组23例,分析T2DM患者骨密度改变与Klotho水平的关系及其影响因素。结果①T2DM组血浆Klotho水平低于NC组(4.92±0.47vs5.38±0.60,P<0.01),协方差分析后Klotho水平仍存在组间差异(P<0.01);②多元逐步回归分析显示,胰岛素敏感指数(ISI)和血肌酐(Scr)是Klotho水平的独立相关因素(B分别为2.743、-0.004,P均<0.05);③BMDO组、BMD1组和OP组间血浆Klotho水平比较无统计学差异(4.95±0.48vs4.96±0.47vs4.91±0.49,P>0.05);④第1、2、3、4腰椎、腰椎均值、股骨颈、股骨大粗隆和全身均值骨密度与血浆Klotho水平均无相关性(P均>0.05);⑤Logistic回归分析显示,年龄、DM病程、HDL-CIBMI是影响T2DM患者骨密度改变的独立相关因素(B分别为0.037、0.005、-1.011、-0.175,OR分别为1.038、1.005、0.364、0.84)。结论(1)T2DM患者血浆Klotho水平降低,其水平与胰岛素敏感指数独立相关,血浆Klotho水平可能是一个反映患者胰岛素抵抗及T2DM发生的监测指标。(2)T2DM患者骨密度下降及骨质疏松可能与血浆Klotho水平无相关性,而年龄和DM病程是其危险因素,HDL-C和BMI是其保护因素。
文中主要英文縮写第5-6页
摘要第6-7页
Abstract第7-12页
前言第13-16页
第一部分 ASP-PCR和FQ-PCR方法检测Klotho基因G-395A、 F352V、 C370S多态性的比较第16-34页
    引言第16-17页
    材料与方法第17-24页
    结果第24-30页
    讨论第30-33页
    结论第33-34页
第二部分 Klotho的三个位点SNP与2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性研究第34-49页
    引言第34-35页
    材料与方法第35-36页
    统计学处理第36页
    结果第36-44页
    讨论第44-48页
    结论第48-49页
第三部分 血漿Klotho水平与1型糖尿病及骨密度改变的相关性研究第49-58页
    引言第49页
    材料与方法第49-52页
    统计学处理第52页
    结果第52-55页
    讨论第55-58页
    结论第58页
参考文献第58-63页
综述第63-69页
    参考文献第67-69页
攻读学位期间发表文章情况第69-70页
致谢第70页
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