研究背景心血管病(CVD)是21世纪人类面临最大的威胁之一,超过40％的心血管病死亡是由冠心病(CAD)引起的,其中最主要的病理机制是心肌梗死后不断进展的心室重塑。心室重塑指在各种不良因素刺激下,心肌细胞坏死、凋亡和肥厚,且细胞外基质出现胶原沉积和纤维化,导致心脏功能逐渐降低。其主要表现为心室容积增大、左心功能受损,严重影响心肌梗死患者预后。如何及早阻止心室重塑发生、发展对改善CAD患者预后意义重大。2003年,日本学者Hiroaki Shimokawa发现低能量体外心脏震波(CSWT)可以改善慢性心肌缺血患者的症状及延缓心室重塑,但对其显效机制研究尚少。本研究采用改良微创堵闭法制作猪心肌梗死模型。在急性心肌梗死后早期实施不同方案体外心脏震波处理,观察实验猪经CSWT处理后心肌局部促血管生成因子(VEGF)水平及其受体的基因和蛋白表达；观察左室功能和结构改变,观察局部心肌病理切片中毛细血管密度变化；检测基质金属蛋白酶及其抑制因子的基因表达差异,评价CSWT对心肌梗死边缘区局部基质代谢的影响。综合多项指标的变化评价CSWT对猪急性心肌梗死后心室重塑的影响。阐明CSWT延缓心室重塑的显效机理,并为优化CSWT方法学提供科学依据。第一部分改良微创堵闭法制作猪急性心肌梗死模型目的：比较两种改良的冠状动脉微创堵闭技术制作猪急性心肌梗死模型的成功率,效率及方法学。方法：选取健康本地小型猪30只,3～5月龄,体重26.5±4.8(25～33) kg,随机分为A(13只)、B(17只)两组。采用自制球囊栓子经导管植入并持续堵闭前降支(LAD)中远端构建急性心肌梗死模型,其中A组采用“球囊堵闭+栓子植入”法,B组采用“栓子直接植入法”。对比两种方法建模成功率,效率,耗费时间及方法学细节。结果：成功制作心肌梗死模型26只, A组成功率84.6%(11/13),B组成功率88.2%(15/17),两组相比无统计学差异(p=0.56)。两种方法的心肌梗死灶分布无显著差异(p>0.05)；B组平均导管操作时间为28.4±9.4min明显短于A组105.8±27.6min, p<0.001。结论：改良微创方法植入永久性球囊栓子持续堵闭冠状动脉靶血管建立猪急性心肌梗死模型的方法可为血管新生治疗研究提供一个持续稳定缺血的实验模型,而直接栓子植入的方法具有耗时短,成功率高、术中死亡率低并且能较好模拟临床心肌梗死发生、发展过程,是心肌梗死动物模型研究中重要的方法学改良。第二部分体外心脏震波对猪急性心肌梗死后局部VEGF及其受体的影响目的：观察CSWT对猪急性心肌梗死后的心肌局部VEGF及其受体表达有无影响,评价不同震波方案影响VEGF及其受体表达的差异。为优化CSWT方法学提供依据。方法：选取本地小型猪30只,3～5月龄,体重26～32 kg。其中20只来自第一部分研究成功构建模的实验猪,随机分为震波组15只和假震波组5只；震波组按处理方案等分为标准治疗、延长疗程及扩大范围3个亚组。另10只健康猪随机分为假手术组和空白对照组各5只。所有实验猪1月后处死,采用RT-PCR和Western Blot技术检测并对比冠状动脉前降支支配区心肌组织中的VEGFmRNA及蛋白表达差异。结果：通过GAPDH标化后VEGFmRNA表达相对量,震波组、假震波组、假手术组及空白对照组分别是2.90±0.40、2.12±0.50、1.96±0.84及1.74±0.32。与假震波组相比,震波组心肌VEGF mRNA表达相对量明显增高(P<0.01),假震波组、假手术组及空白对照组组间比较均无差异显著性(P=0.08)。震波治疗后Flt-1 mRNA表达相对量与其它处理组相比未见显著差异。震波治疗亚组分析显示延长疗程组心肌VEGF mRNA表达相对量最高,与扩大范围治疗及标准治疗组间均有明显差异,而后两组间差异未见显著性。对VEGF蛋白表达相对量的影响比较显示震波组显著高于假震波组(11.6±2.4Vs 8.7±0.9,P<0.0001)。结论：心脏震波显著上调急性心肌梗死模型猪局部心肌组织促血管生长因子基因及蛋白表达；不同震波治疗方案血管新生的效果可能存在差异。心肌梗死后早期延长疗程震波治疗更有助于血管新生的机理可能是心肌微环境的得到持续改善,可能是更有效的CSWT策略。第三部分体外心脏震波对猪急性心肌梗死后早期心肌微循环重建的影响目的：观察CSWT对猪急性心肌梗死后的心肌局部毛细血管有无影响,对比不同震波方案影响心肌局部新生微血管的差异。为优化CSWT方法学提供进一步科学依据。方法：选取本地小型猪30只,3～5月龄,体重26～32 kg。实验猪分组及处理同第二部分。所有动物30d通过选择性冠状动脉造影评价心肌侧枝循环分级；麻醉状态下处死后取活体心脏,取冠状动脉前降支支配区心肌组织行Ⅷ因子相关抗原标记免疫组化染色测定心肌毛细血管密度；结果：震波组动物Ⅷ因子染色阳性毛细血管数明显多于假震波及假手术组,量化分析比较显示震波组与假震波组间相比具有差异显著性(1856±78 vs.837±54/mm2,P<0.0001)；震波组中心肌毛细血管新生最多者依次为延长震波疗程亚组(2353±47/mm2),扩大治疗范围亚组(1695±32/mm2)和标准震波亚组(1633±24/mm2)其中后两种方案间无显著差异性(P>0.05)；假震波及假手术组间毛细血管新生效果比较未见显著差异性(837±54 vs.569±32/mm2, P>0.05)。通过选择性血管造影评价侧枝循环Rentrop分级,震波组与假震波组比较差异有统计学意义(2.05±0.11vs0.98±0.09,P=0.03)。结论：CSWT能明显促进局部心肌微循环结构的重建,而且心肌梗死后早期延长疗程震波可能使利于心肌血管新生的微环境得到持续改善,从而更有助于局部心肌微循环的重建,可能是CSWT改善心肌缺血最重要的潜在理论机制。第四部分体外心脏震波对猪急性心肌梗死后心肌局部MMP1/TIMP1的影响目的：观察体外心脏震波对猪急性心肌梗死后局部心肌MMP1/TIMP1基因水平的影响,进一步探讨CSWT改善心室重塑的潜在机制。方法：选取本地小型猪30只,3～5月龄,体重26～32 kg。实验猪分组及处理同第二部分,30d后取心肌组织通过RT-PCR检测交界区MMP1, TIMP1 mRNA表达水平,对比不同处理因素对局部心肌基质金属蛋白酶及抑制因子水平变化差异。结果：通过GAPDH标化后MMP1/TIMP1mRNA表达相对量比较显示：与假震波组相比,震波组梗死局部心肌MMP1mRNA表达相对量明显下降(0.94±0.19vs1.35±0.32, P<0.001), TIMP1mRNA表达相对量显著升高(3.29±0.91vs2.02±0.64,P<0.001)。CSWT使梗死心肌局部MMPs mRNA表达水平下调,TIMPs mRNA表达水平升高与VEGF mRNA表达水平上调,促进局部心肌组织新生毛细血管增生等心室重塑重要影响因素的变化实验结果相吻合。结论：体外心脏震波可上调促血管新生因子表达水平,诱导急性缺血区血管新生并重建局部心肌微循环,这些改善效应均有可能是CSWT影响心肌梗死后心肌局部MMP/TIMP代谢表达并进一步调节心肌基质代谢平衡,缓解心肌梗死后心室重塑发展的重要分子生物机制。第五部分体外心脏震波对猪急性心肌梗死后左心室功能及形态的影响目的：通过观察CSWT对急性心肌梗死后左心室心功能及形态学指标的影响,评价CSWT在延缓心肌梗死后左心室重塑治疗中的应用价值,同时优化CSWT方法学。方法：选取本地小型猪30只,3～5月龄,体重26～32 kg。实验猪分组及处理同第二部分。通过对比不同治疗期间及不同处理组间超声心动图及左心室造影检测室壁运动协调性,心功能,室间隔,左室后壁厚度及各心腔室容积变化差异,综合评价CSWT对心肌梗死后心室重塑的影响。结果：与假震波组相比震波治疗明显改善LVESV、LVEDV及LVEF (LVESV,53.0±1.5vs64.7±1.4ml, P<0.001; LVEDV,90.2±7.8vs98.7±5.3ml, P<0.03; LVEF,47.8±4.6vs39.2±6.2%,P<0.001)；同时CSWT能显著改善心肌梗死交界区心肌局部室壁运动功能和左心室各节段运动协调性。心脏震波亚组分析发现延长震波疗程较标准治疗在对左室收缩末径,室间隔厚度方面可获得更多益处(LVESD: 17.8±3vs23.0±3.2, P=0.016; IVS:5.9±0.4vs5.0±0.9, P=0.048)。扩大治疗范围亚组较标准治疗亚组在对左室收缩末径影响方面表现更佳(LVESD:17.2±2.4vs23.0±3.2,P=0.009)。对局部心肌功能和室壁运动的影响方面,不管是哪一种震波治疗方案均比假震波组的各项指标有明显改善,而亚组间对比未发现各震波治疗方案间有明显的疗效差异。结论：心室重塑发生于心肌梗死早期并呈一个持续发展的过程。梗死后早期实施CSWT能明显改善心肌梗死后左心室整体心功能,局部心肌运动功能和室壁运动协调性,且延长震波疗程的方案可获得更明显益处。因此,认为及早有效的进行CSWT可在一定程度上延缓心肌梗死后左心室重塑由可逆阶段向不可逆阶段发展。总结全文,CSWT从基因、细胞及组织水平改善了急性心肌梗死心肌局部血管新生微环境,促使血管内皮细胞增生,并在一定程度上改善了影响心脏重塑发展的基质代谢,最终在器官水平发挥逆转或延缓心室容积增大及左心功能受损的不良病理生理过程。延长疗程的CSWT方案将有可能为临床优化CSWT方法学提供科学依据。
