灰藤黄链霉菌P510中吩嗪类抗生物质的纯化鉴定及发酵优化

灰藤黄链霉菌P510（Streptomyces griseoluteus P510）是本实验室从土壤中分离得到的，前期研究发现其胞外产物中含有吩嗪类活性物质灰藤黄菌酸（griseolutein acid，GA）。但是，在GA的纯化过程中，发现S. gri-seoluteus P510的胞外产物中还有其它活性组分，同时发现P510的胞内产物也具有一定的生物活性。因此，本论文对S. griseoluteus P510发酵产物中的其它活性组分了进行了分离纯化和结构鉴定，同时初步研究了发酵培养基对这些组分合成的影响。首先，以抑菌活性、产物颜色及光吸收波长等吩嗪类物质的特性作参考，对S. griseoluteus P510的代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定。通过将S. griseoluteus P510发酵液经过等体积的酸性乙酸乙酯萃取，流动相为甲醇-氯仿（1:9）的常压硅胶柱层析及制备型薄层层析，流动相为甲醇-0.1%乙酸水（55:45）的C18反相高效液相层析，最终从10L发酵液中纯化得到3.2mg的纯物质A及9.1mg的GA。同时，S. griseoluteus P510菌丝体经过丙酮萃取，流动相为甲醇-0.1%乙酸水（55:45）的C18反相高效液相层析，最终从20.1g菌丝体中纯化得到6.5mg的纯物质IX。通过全波长扫描、ESI-MS及UPLC-MS-MS、1H-NMR波谱技术，并结合相关文献，鉴定物质A的结构为吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid, PCA），物质IX的结构为1-羟基吩嗪（1-hydroxyphenazine,1-OH-PHZ）其次，考察了GA、PCA和1-OH-PHZ对西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、水稻稻瘟菌、甜叶菊斑枯病菌、番茄早疫病菌和油菜菌核病原菌这六种植物病原真菌的抑菌活性。结果表明三种产物都具有明显的抑菌活性，并且对西瓜枯萎病具有最高抑菌活性，PCA、GA和1-OH-PHZ对其最小抑菌浓度分别为<1μg/mL、2μg/mL和2μg/mL。最后，考察了培养基中碳源种类（8g/L的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油）、氮源种类（2g/L的硫酸铵、黄豆饼粉、蛋白胨和酵母提取物）、碳/氮比（葡萄糖-酵母提取物4:1、1:1和1:4）以及无机盐种类（0.5g/L的MgCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和MnSO4·H2O）对S. gri-seoluteus P510发酵时三种吩嗪类代谢产物合成的影响。结果表明葡萄糖、酵母提取物和MgCl2有利于GA和PCA的合成，而甘油、黄豆饼粉和MgCl2有利于1-OH-PHZ的合成；碳/氮比为1:1有利于GA和1-OH-PHZ的合成，碳/氮比为4:1有利于PCA的合成。以产量最高的GA为例，采用5g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物和0.5g/L的MgCl2·6H2O为培养基，培养96小时后，GA的最高产量达到了146.4±3.6mg/L，比优化前的酵母-淀粉II培养基（可溶性淀粉8g/L，酵母提取物2g/L）中的产量提高了约5.6倍吩嗪类化合物由于其结构和活性的多样性，成为一类极有价值的生防抗生素，而链霉菌则是天然吩嗪类化合物的重要来源。本论文从S. gri-seoluteus P510胞内和胞外代谢产物中纯化鉴定了1-OH-PHZ和PCA，并初步研究了培养基对S. griseoluteus P510发酵吩嗪类产物合成的影响，为后续定向提高目标产物的产量以及深入研究不同吩嗪类物质的合成和转化机制打下了基础。