苦荞麦胰蛋白酶抑制剂的分离纯化、基因克隆表达及其抗病虫害研究

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蛋白质性质的丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛地分布于各种植物中,尤其是种子中。它们对植物病原真菌和食草昆虫都具有广谱的抗性。本研究采用离子交换层析、亲和层析和离心超滤等分离纯化方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂((FtTI)。FtTI在还原和非还原条件下电泳都表现出单一的条带,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化产物进行分析得出,FtTI的近似分子量大约为14.0 kD。对其性质研究表明:FtTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,FtTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比为1:1,迪克森作图法显示,该抑制剂属竞争性抑制类型,该抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制常数为1.6 nM(以BApNA为底物)。Edman降解法测序显示,FtTI的N末端氨基酸序列为V-G-K-Q-S-W-P-E-L-V,与甜荞麦的胰蛋白酶抑制剂N端序列有80%相似性,这表明FtTI与荞麦属的其它蛋白酶抑制剂具有很高的同源性。FtTI在20-80℃条件下具有较高的热稳定性,在80℃处理30 min后可保留84%左右的抑制活性。FtTI在强酸性和强碱环境下都较为稳定,FtTI的最适pH值为8.0,在pH3.0-10.0条件下,能保持90%以上的抑制活性。高温高压条件下,FtTI很快被钝化,FtTI在0.198/120 MPa/℃和0.143/110MPa/℃条件下,作用20 min分别失去其抑制活性的97%和93%。而超声波对FtTI的钝化作用却与其振幅及作用时间成正比。根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,PCR扩增出苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因(FtTI)的保守序列,然后以苦荞麦DNA为模板,采用染色体步移技术扩增出该基因的5’末端,再以苦荞麦cDNA为模板采用3’RACE技术,扩增FtTI基因的3’末端,最后通过CExpress软件拼接得到了FtTI基因的全长序列,它的基因全长为644 bp,含有一个264 bp的完整开放阅读框,编码87个氨基酸,具有植物丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的典型特征,即在N-端有保守的WPELVG区,中部有保守的XENXXV区,C-末端有保守的RCDRV区。Blast蛋白质序列比对分析表明,苦荞麦胰蛋白酶抑制剂与蓖麻子(Ricinus communis) XM 002520961. 1、接骨木(Sambucus nigra) Z46949.1、与麻风树(Jatropha curcas) FJ906844.1、龙葵(Solanum nigrum) ADP05502.1、百日草(Zinnia violacea) AB091073.1、丹参(Salvia miltiorrhiza) EF187459.1、甜荞(Fagopyrum esculentum) AAB46906.1和马铃薯(Solanum tuberosum) AAS46024.1等的丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源性分别为:67.8%、66.6%、65.5%、64.3%、643%、60.1%、59.7%和54.7%。上述结果表明,已成功获得了苦荞麦FtTI基因。FtTI分子中含有87氨基酸残基,利用ClustalW程序软件进行多重序列比对发现,FtTI有两对二硫键分别为Cys8-Cys65和Cys49-Cys58,活性位点为Arg67-Val68,氨基酸序列比对分析表明,FtTI属于蛋白酶抑制剂Ⅰ家族。将FtTL基因插入到表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-rFttI,并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS 115中高效表达,经过MD平板筛选和蛋白酶抑制活性测定,证明获得了高效表达的转化子GS115-FtTIⅦ。在摇瓶培养条件下,利用单因素试验和响应面中心组合设计对酵母工程菌表达条件进行了优化,得到了最适的诱导表达条件,即发酵量5%-15%、甲醇含量0.25%-0.75%和诱导时间在2.5-3.5d时,对rFtTI的表达最为有利,该重组蛋白质在摇瓶内的表达量为489.6-527.4 U/mg。该重组表达蛋白质经亲和层析和离心超滤两步纯化后,通过SDS-PAGE电泳检测,其分子质量大约13.8 kDa。从1L发酵液总共能够得到287 mg重组蛋白,表达量为527.4 U/mg。纯化后的rFtTI能有效地抑制胰蛋白酶的活性,以苯甲酰-DL-精氨酰-对硝基苯胺(BApNA)为底物,迪克森作图法分析显示,对牛胰蛋白酶的抑制常数为1.59 nM,该抑制剂属于竞争性抑制剂。FtTI强烈地抑制南瓜蔓枯病、佛手瓜叶枯病、番茄早疫病和辣椒炭疽病等病原真菌菌丝的生长。在5-30μg/mL条件下,FtTI几乎完全抑制南瓜蔓枯病、佛手瓜叶枯病、番茄早疫病、辣椒疫病和辣椒炭疽病等病原真菌菌丝的生长。即使在FtTI的浓度大于100μg/mL条件下,小麦赤霉病和玉蜀黍赤霉病病原真菌菌丝的生长却不受什么影响。显微镜下观察发现,与正常菌丝相比,南瓜蔓枯病、辣椒疫病、菜豆角斑病和辣椒炭疽病的菌丝变得细小,玉米大斑病菌丝产生了畸形,豇豆轮纹病的菌丝产生了顶端畸形。用含有纯化的rFtTI人工饲料饲喂甘蓝夜蛾幼虫,试验结果表明,纯化的rFtTI对甘蓝夜蛾幼虫没有生长发育抑制作用,然而,纯化的rFtTI对甘蓝夜蛾具有较强毒杀作用,其毒杀作用表现比较缓慢,在处理3d以后才开始逐渐表现出较高的毒杀作用,尽管甘蓝夜蛾取食不同浓度的rFtTI,其累计死亡率都是95%,但是随着取食rFtTI浓度的增加,其到达死亡的时间越短。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-8页
第一章 文献综述第11-25页
    1.1 植物病虫害的危害第11-13页
    1.2 蛋白酶抑制剂研究进展第13-16页
    1.3 荞麦蛋白酶抑制剂研究进展第16-17页
    1.4 植物基因的克隆和表达第17-20页
    1.5 荞麦胰蛋白酶抑制剂的研究现状第20-22页
    1.6 目前存在的问题和研究前景第22-23页
    1.7 本次研究的目的和意义第23-25页
第二章 苦荞胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质分析第25-44页
    1. 材料、试剂和仪器第25-26页
        1.1 材料第25页
        1.2 试剂和仪器第25-26页
    2. 方法第26-33页
        2.1 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方案第26-27页
        2.2 FtTI的提取和纯化第27-29页
        2.3 胰蛋白酶抑制剂活性测定第29-30页
        2.4 FtTI的抑制动力学参数测定第30页
        2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳第30页
        2.6 蛋白质含量测定采用Bradford法第30页
        2.7 基质辅助飞行时间质谱分析第30-31页
        2.8 氨基酸组成分析及N-端氨基酸序列测定第31-32页
        2.9 FtTI的pH和热稳定性第32页
        2.10 FtTI的钝化第32-33页
    3. 结果与分析第33-41页
        3.1 FtTI的纯化第33-35页
        3.2 FtTI的质谱分析第35页
        3.3 FtTI的抑制动力学参数分析第35-37页
        3.4 FtTI的氨基酸含量和N-端氨基酸序列测定第37-38页
        3.5 FtTI的pH和热稳定性第38-39页
        3.6 FtTI的钝化第39-41页
    4. 讨论第41-44页
        4.1 FtTI的分离纯化第41-42页
        4.2 FtTI的性质分析第42-44页
第三章 苦荞胰蛋白酶抑制剂基因全长序列的克隆表达第44-74页
    1. 材料、试剂和仪器第44-46页
        1.1 材料第44页
        1.2 试剂和仪器第44-45页
        1.3 培养基第45-46页
    2. 实验方法第46-59页
        2.1 实验路线第46页
        2.2 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因全长序列的克隆第46-54页
        2.3 FtTI基因全长序列的获得及其在毕赤酵母中的高效表达第54-58页
        2.4 GS115-FtTI表达条件的优化第58-59页
        2.5 GS115-FtTI表达产物的纯化第59页
        2.6 rFtTI的抑制活力及抑制常数的测定第59页
    3. 结果与分析第59-70页
        3.1 苦荞麦DNA和RNA的提取第59-60页
        3.2 FtTI基因保守区的克隆第60-61页
        3.3 FtTI基因5'末端序列的克隆第61-62页
        3.4 FtTI基因3'末端序列的克隆第62页
        3.5 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因全长序列的拼接第62-65页
        3.6 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因全长序列的获得第65-66页
        3.7 pPIC9k-FtTI在毕赤酵母中的高效表达第66页
        3.8 GS115-FtTIⅦ表达条件的优化第66-69页
        3.9 rFtTI的纯化及抑制活性检测第69-70页
    4. 讨论第70-74页
        4.1 荞麦胰蛋白酶抑制剂基因研究现状第70-71页
        4.2 引物设计第71页
        4.3 重组表达载体的构建第71-72页
        4.4 毕赤酵母表达研究第72页
        4.5 表达条件优化研究第72-73页
        4.6 重组苦荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导表达、纯化和鉴定第73-74页
第四章 苦荞胰蛋白酶抑制剂的抗病虫害研究第74-87页
    1. 材料、试剂和仪器第74-76页
        1.1 材料第74-75页
        1.2 试剂和仪器第75页
        1.3 培养基第75-76页
    2. 实验方法第76-77页
        2.1 抑制植物病原真菌实验第76-77页
        2.2 FtTI的抗虫性研究第77页
    3. 结果与分析第77-85页
        3.1 FtTI的抗病原真菌效果第77-81页
        3.2 FtTI纯化产物的抗虫效果第81-85页
    4. 讨论第85-87页
        4.1 FtTI的抗植物病原真菌实验第85页
        4.2 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂的抗虫性研究第85-86页
        4.3 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂应用前景第86-87页
小结第87-89页
    本论文主要的创新点第87页
    研究展望第87-89页
参考文献第89-93页
致谢第93-94页
1.申请专利第94页
2.发表论文第94页
3.在审论文第94-95页
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论文编号ABS539434,这篇论文共95页
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