Hedgehog信号通路通过基质金属蛋白酶-7调节卵巢癌的侵袭与转移

研究背景与目的：卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率非常高的恶性肿瘤，在近三十年中死亡率并没有呈下降趋势。由于其发病隐匿，早期诊断相当困难，一旦发现已有远处转移。Hedgehog(Hh)信号通路参与胚胎的发育及成人体内稳态的维持，在机体发育中扮演重要的角色。近年来研究显示多种恶性肿瘤的发生、发展与Hh信号通路的异常激活有关，包括卵巢癌。但Hh信号通路怎么参与调控卵巢癌的侵袭与转移的分子机制仍不清楚。本实验从细胞分子水平及动物模型水平来初步探讨Hh信号通路参与卵巢癌侵袭与转移的分子机制及寻找卵巢癌的早期诊断治疗靶点，为卵巢癌新药研发提供理论根据。研究方法：(1)根据NCBI查询到的MMP7cDNA序列在Invitrogen网站上设计3个靶向MMP7的干扰序列，连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中构建重组质粒，分别命名为miRMMP7-158、314、688。用脂质体2000将MMP7干扰质粒转染人卵巢癌SKO-V3细胞，并用倒置荧光显微镜观察荧光强度以确定转染效率。蛋白免疫印迹（Western blot）筛选有效的干扰片段。(2)以优化了的转染条件【plasmid（ug）：Lipofectamine2000(ul)=1:3】转染人卵巢癌细胞SKO-V3，并通过划痕实验和Transwell细胞侵袭实验检测细胞迁移与侵袭能力。(3)分别用GANT61（Hh信号通路的抑制剂）与SHH信号通路配体条件培养液（Hh信号通路激活剂）处理人卵巢癌细胞SKO-V3，然后通过real-TimePCR和Western blot实验检测MMP7mRNA水平和蛋白水平的表达。(4)用GANT61裸鼠皮下注射后检测人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤组织中MMP7蛋白表达水平的改变。结果：(1)成功构建干扰质粒（miRMMP7-158、314、688），该质粒转染SKO-V3细胞的荧光率大于80%。经Western blot检测MMP7蛋白表达，其中MMP7-158为最佳干扰质粒（p＜0.05）。(2)转染阴性对照质粒组其侵袭与转移能力均明显强于转染干扰质粒组（p＜0.05）；转染阴性对照质粒的SKO-V3细胞，加入SHH配体条件培养液组其侵袭与迁移能力明显强于加入对照培养液组（p＜0.05）；转染miRNAMMP7-158质粒的SKO-V3细胞，加入SHH配体条件培养液组其侵袭与迁移能力与加入对照培养液组无差异（p＞0.05）。(3)经SHH配体条件培养液刺激后，SKO-V3细胞中MMP7的mRNA及蛋白水平的表达随处理时间延长逐渐增高（p＜0.05）；而经GANT61（20μM）处理后的SKO-V3细胞中MMP7的mRNA及蛋白表达水平随处理时间延长逐渐降低（p＜0.05）。(4)免疫组化结果显示，经GANT61皮下裸鼠注射的人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤组织中，MMP7蛋白表达明显低于对照组（p＜0.05）。结论：1. SHH配体条件培养液激活Hh信号通路，卵巢癌细胞的侵袭与迁移能力明显增强，干扰MMP7表达后，能有效抑制卵巢癌细胞的侵袭与迁移能力，在干扰掉MMP7的SKO-V3细胞中无论是否激活Hh信号通路，卵巢癌细胞的侵袭与迁移能力皆减弱，以上结果提示Hh信号通路很可能是通过MMP7的表达来调控卵巢癌的侵袭与转移。2.采用Gli特异性小分子抑制剂GANT61处理SKO-V3细胞后， MMP7的mRNA及蛋白表达水平下降；用SHH配体条件培养液激活Hh信号通路后，卵巢癌细胞SKO-V3中MMP7的mRNA及蛋白表达水平增强；GANT61可能有效抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤的体积及重量，且实验组中MMP7的蛋白表达水平下降；提示MMP7可能是Hh信号通路的下游靶基因，Hh信号通路有望成为卵巢癌诊疗策略的新靶点，为抗癌新药研发提供理论依据。