狂犬病病毒CVS-P蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选及初步的功能研究

狂犬病是由嗜神经性的狂犬病病毒（RABV）感染引起的一种重要的人兽共患传染病，一旦发病，几乎全部死亡。RABV属于弹状病毒科，狂犬病病毒属，是一种不分节段的单股负链RNA病毒，其基因组编码5种结构蛋白，分别为N、P、M、G、L蛋白。已有研究表明，RABV P蛋白是一种聚合酶辅助因子，参与了该病毒基因组的转录和复制过程。当RABV感染宿主后，P蛋白通过和宿主蛋白STAT1、STAT2和STAT3等相互作用，抑制宿主细胞内IFN信号转导，使得RABV能够逃避宿主免疫，以利于病毒在宿主体内的传播及扩散。P蛋白还能够和LC8作用，可能介导该病毒在神经元内的逆轴浆传输，成为研究RABV致病机制的重要靶点蛋白。但到目前为止，RABV致病机制，特别是与P蛋白存在相互作用的宿主蛋白尚不明确，而对后者的深入揭示，可望为RABV致病机制的研究补充更多实验数据。CVS作为RABV国际标准攻击毒株，对于其研究更具泛示性。酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）是研究蛋白质相互作用、筛选新蛋白质的重要工具。为了寻找能够与CVS-P具有相互作用的新宿主蛋白，我们首先通过PCR扩增得到CVS-P的全长基因并构建了酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-CVS-P，然后将诱饵质粒转化Y2HGold酵母细胞，证实了该蛋白对酵母细胞无毒性且无自激活作用；将含有诱饵质粒的Y2HGold酵母菌和含有人脑cDNA文库的Y187酵母菌进行培养，通过营养缺陷型培养基反复多次筛选阳性克隆，获得24个阳性克隆；挑取单个酵母蓝色阳性克隆提取质粒，转化大肠杆菌并提取质粒，经PCR鉴定最终得到12个阳性克隆。将这些阳性克隆质粒测序，并与NCBI数据库进行序列比对和分析，结果显示，其中8个克隆为SNAP-associated protein (Snapin)，1个克隆为zinc finger protein350(ZNF350)，3个克隆为COP9signal some subunit5(COPS5)。经酵母回转实验验证，上述3种蛋白与P蛋白均存在相互作用，与Snapin蛋白的信号最强。Snapin是一种与突触相关的多功能蛋白，与鹦鹉热、风湿性关节炎、帕金森、前列腺癌等及多种病毒性疾病疾病相关。Snapin是SNARE复合物的重要组分，主要分布在胞浆，参与突触前稳态的维持、BACE1等逆神经元轴浆运输、调节人类巨细胞病毒解旋酶细胞内分布、诱导钙离子的释放进而影响HIV-1在T细胞中的复制。尽管Snapin具有上述多重功能，近几年对其研究也逐渐增多，但尚未见与RABV相关的研究，所以我们将Snapin蛋白作为进一步研究的重点。.首先通过GST pull-down技术和免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）技术证实了CVS-P和Snapin蛋白在体内和体外均存在相互作用；通过免疫荧光实验证实了二者在细胞内共定位于胞浆；应用Real-time PCR和Western blot检测，RABV感染鼠脑Snapin mRNA和蛋白水平与对照相比都呈上调趋势，当Snapin蛋白过表达时，P蛋白mRNA和蛋白水平均上调。以上实验首次表明，RABVP蛋白与宿主蛋白Snapin存在相互作用，Snapin蛋白可导致P蛋白表达上调，促进RABV复制复合物的形成，利于该病毒的转录及复制，而Snapin又是一种介导突触传递的重要蛋白，可能导致大量复制的病毒颗粒的跨突触扩散，使其致病力增强。当然以上推断还需通过后续试验进行验证，该推断一旦被证实，将为狂犬病的防治提供新的方向。