棕色固氮菌突变种(UW45、DJ54和DJ35)的缺失FeMoco钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究
棕色固氮菌突变种UW_45、DJ_54和DJ_35论文 nifB的点突变、nifH和△nifE的缺失
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一.棕色固氮菌突变种UW45、缺失nifH(DJ54)和缺失nifE(DJ35)突变种的钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究 棕色固氮菌突变种UW45的菌体破碎后,所得粗提物经两次DEAE 52柱层析后得到部分纯的nifB- MoFe蛋白和Fe蛋白。再经Sephacryl S-300和DEAE柱的进一步纯化,便使nifB- MoFe蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯。SDS-PAGE结果表明,nifB- MoFe蛋白具有与野生型棕色固氮菌(OP)MoFe蛋白相同的亚基种类和组成。此粗提物可为用NMF抽提的OP MoFe蛋白的FeMoco激活,所得Fe蛋白具有与OP Fe蛋白相似的互补活性,可使OP MoFe的比活性达到2192nmol C2H2/min/mg蛋白。Fe Moco可使无互补活性的nifB- MoFe蛋白与nifB- Fe蛋白组成具有可观放氢活性的固氮酶,使FeMoco显出的比活性接近文献报道的还原乙炔的最高值。对nifB- MoFe蛋白的结晶及晶体生长进行了的研究,初步探讨了结晶溶液各组分的种类和浓度、结晶方法和实验操作等与能否出现晶体及晶体的数目、大小、质量、形状和出晶时间等的相互关系。在结晶实验时,一次就得到了国内外尚未报道的该蛋白的短斜四棱柱的棕色晶体。目前所得的最大的晶体的二维边长都为0.1mm。初步结果表明,这种晶体可能就是nifB- MoFe蛋白的晶体。 从棕色固氮菌突变种DJ54中得到了△nifH MoFe蛋白;并参与了棕色固氮菌突变种DJ35的△nifE MoFe蛋白的分离纯化,所用方法与nifB- MoFe蛋白的分离纯化相似。对这两种突变种蛋白的特性和结晶进行了初步研究。在结晶实验时,也是一次就得到了国内外尚未报道的△nifHMoFe蛋白和△nifEMoFe蛋白 棕色闽氮菌突变种山。;、DJ;。和 DJ;*的缺失 FeMOCOto铁蛋山的纯化、特吐鉴定及结晶研究 的晶体。 二.新型固氮酶MnFe蛋白和 CrFe蛋白的特性与结晶研究 在已有的工作基础上,分离纯化了几批MnFe蛋白和 CrFe蛋白,并用部分 纯的ugh-Fe蛋白进行活性互补,分别测定了 MnFe蛋白和 CrFe蛋白的底物还原 活性。不断优化MnFe蛋白和 CrFe蛋白晶体生长条件,获得了晶质良好的 MnFe 蛋白和 CrFe蛋白的较大晶体。 在2001年的“神舟2号”飞船搭载实验中,MnFe蛋白的出晶率达到100%, 所获得的晶体也比地面对照略厚些。继续进行MnFe蛋白和 CrFe蛋白的空间计 划的地面匹配实验,以满足对蛋白质样品的要求,以保证宇宙飞船“神舟3号” 的蛋白质搭载实验获得更好的结果。
中文摘要 | 第5-7页 |
英文摘要 | 第7页 |
第一章 引言 | 第9-15页 |
一、 固氮酶生物化学,分子生物学及结构生物学研究 | 第9-13页 |
1 固氮酶的基本组成结构与基因编码 | 第9-10页 |
2 固氮酶MoFe蛋白及其与Fe蛋白的固氮酶复合物晶体的结构 | 第10-12页 |
3 突变种固氮酶的结构与功能研究 | 第12-13页 |
二、 固氮酶生物多样性研究 | 第13-15页 |
第二章 材料与方法 | 第15-23页 |
一、 试剂配制 | 第15-17页 |
1 修改的Burk's培养基 | 第15页 |
2 奈氏试剂 | 第15页 |
3 除氧溶液 | 第15页 |
4 Tris-HCl缓冲液及不同离子强度的厌氧Tris-HCl缓冲液 | 第15-16页 |
5 测蛋白浓度所用的试剂 | 第16页 |
6 ATP发生系统 | 第16页 |
7 蛋白质晶体生长所需的试剂 | 第16-17页 |
二、 实验材料及样品制备 | 第17-20页 |
1 棕色固氮菌及其突变种的培养 | 第17页 |
2 酶的分离纯化 | 第17-20页 |
2.1 突变种UW_(45)固氮酶nifB~- MoFe蛋白和nifB~- Fe蛋白的分离纯化 | 第17-19页 |
2.2 突变种DJ_(54)固氮酶△nifH MoFe 蛋白的分离纯化 | 第19-20页 |
三、 实验方法 | 第20-23页 |
1 蛋白质浓度测定 | 第20-21页 |
2 固氮酶及与异源固氮酶两组分互补的C_2H_2及H~+还原活性的测定 | 第21页 |
3 电泳分析 | 第21页 |
4 蛋白质结晶方法 | 第21-23页 |
第三章 试验结果与讨论 | 第23-45页 |
1 突变种nifB~- MoFe蛋白蛋白的分离纯化、特性鉴定与结晶研究 | 第23-31页 |
1.1 棕色固氮菌突变种UW_(45)培养 | 第23-24页 |
1.2 突变种nifB~- MoFe蛋白MoFe蛋白的分离纯化 | 第24页 |
1.3 nifo~- MoFe蛋白的特性鉴定 | 第24-26页 |
1.4 nifB~- MoFe蛋白结晶研究 | 第26-31页 |
1.4.1 Hepes缓冲液的浓度 | 第27页 |
1.4.2 PEG 8000的浓度 | 第27-29页 |
1.4.3 MgCl_2和NaCl的浓度 | 第29-30页 |
1.4.4 结晶方法及其实验操作的影响 | 第30-31页 |
2 突变种△nifH MoFe蛋白和△nifE MoFe蛋白的分离纯化与结晶研究 | 第31-34页 |
2.1 △nifH MoFe蛋白的分离纯化和特性鉴定 | 第31-32页 |
2.2 △nifH MoFe蛋白的初步结晶研究 | 第32-33页 |
2.3 △nifE MoFe蛋白的初步结晶研究 | 第33-34页 |
3 新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白的研究 | 第34-45页 |
3.1 新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白特性研究进展 | 第34-37页 |
3.1.1 MnFe蛋白和CrFe蛋白的亚基组成 | 第34-35页 |
3.1.2 MnFe蛋白和CrFe蛋白的底物还原活性 | 第35-37页 |
3.2 新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白的晶体生长进展 | 第37-45页 |
3.2.1 结晶溶液系统的选择 | 第37-38页 |
3.2.2 PEG 8000、MgCl_2和NaCl最适浓度组成的筛选 | 第38-42页 |
(i) PEG 8000 | 第38-40页 |
(ii) MgCl_2 | 第40-42页 |
(iii) NaCl | 第42页 |
3.2.3 最适的结晶方法 | 第42-45页 |
第四章 结论 | 第45-46页 |
参考文献 | 第46-52页 |
缩略语表 | 第52-53页 |
攻读硕士学位期间已发表的的研究论文 | 第53-54页 |
致谢 | 第54-55页 |
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