玉米丝氨酸羧肽酶基因（ZmSCP）的克隆及功能分析

植物在其长期进化过程中常受到一些病原微生物的侵袭；植物和病原微生物在生态系统中长期并存,相互影响,乃至协同进化。在这一过程中植物逐渐形成了一系列防御机制来保护自己。植物抗病反应是一个非常复杂的过程,涉及到多种调控防卫反应,包括对病原微生物的识别、信号传导途径中的信号传导、抗病反应基因的调控和表达等。丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因和丝氨酸羧肽酶类蛋白(serine carboxypeptidases-like, SCPL)在植物伤应答反应、油菜素内酯等合成途径中起着重要作用。本研究以玉米高耐纹枯病自交系R15和烟草W38为实验材料,利用电子克隆、RACE技术从R15中克隆了玉米丝氨酸羧肽酶基因；利用半定量RT-PCR和Real-time PCR对目的基因表达模式进行分析；利用原核表达系统表达大量蛋白,并进行体外抑菌特性分析。同时,构建过量表达载体转化烟草初步探讨基因的生物学功能,主要研究结果如下：(1)结合电子克隆、RT-PCR技术和RACE技术对与丝氨酸羧肽酶基因同源的EST序列进行克隆。结果显示,该基因全长为1874 bp(GenBank登录号：JF682634),开放阅读框为999 bp,起始于154 bp,终止于1152 bp,5’-UTR区为153 bp,3’-UTR区为722 bp,具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。Protparam程序分析表明该基因编码332个氨基酸,相对分子量为36.505 kD,等电点为4.75,为酸性蛋白。利用Genedoc软件分析同源性,结果显示ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性,同源性比例范围为42%-81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近,属于同一进化分支。现将该基因命名为ZmSCP。(2)利用生物信息学方法对目的基因编码产物的氨基酸组成、蛋白质修饰位点、信号肽区域、亚细胞定位和保守结构域等进行预测和分析。结果显示,该基因编码的氨基酸有四种类型,其中疏水氨基酸最多；蛋白质序列可能有4种修饰方式,即1个N-端糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,8个N-端豆蔻酰化的修饰位点；蛋白质序列无信号肽区域；亚细胞定位结果显示该蛋白多表达于细胞质及微体中；蛋白质序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域,属于S10超家族。(3)提取玉米基因组DNA,利用4种限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SpeⅠ和Bgl II进行酶切。Southern杂交结果显示,四个杂交泳道均有几条杂交带,且呈弥散状,推测该基因可能属于多拷贝。(4)以玉米自交系R15为材料,利用半定量RT-PCR与荧光定量PCR相结合的方法对ZmSCP基因在不同逆境条件下mRNA表达模式进行研究。结果表明,目的基因在不同胁迫条件下,总体均呈诱导表达的趋势。其中,在立枯丝核菌AG1-IA诱导下,ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势,第一次诱导出现在接菌后24 h,然后下降,第二次诱导出现在接菌后60 h,与不接菌相比,出现显著性差异。在ABA、JA、低温和盐胁迫下,ZmSCP基因表达均呈现上调趋势,表达高峰均出现在胁迫后48 h。(5)以立枯丝核菌AG1-IA诱导的高耐玉米纹枯病自交系R15幼苗为材料,通过RT-PCR扩增ZmSCP基因的开放阅读框,先后将其克隆到pMD-18T载体、亚克隆到pET32a(+)表达载体上,获得原核表达载体pET32a(+)-ZmSCP,鉴定正确后转化大肠杆菌BL21,在不同的诱导温度(28℃,37℃)、不同浓度(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)的IPTG、不同诱导时间(0,2,4,6,8,10 h)下对诱导体系进行优化。结果表明,ZmSCP基因的最佳诱导体系为0.6 mmol/L IPTG在37℃诱导6 h,经Western blot检测证实有58 KD的融合蛋白存在,SDS-PAGE和Western blot均证明目的蛋白在大肠杆菌中成功表达。(6)目的蛋白经Ni-NTA树脂纯化,定量后设置三个不同浓度,以PBS溶液为对照与立枯丝核菌进行共培养,培养24h后观察菌丝的生长并进行拍照,同时测量抑菌圈大小,并在显微镜下观察菌丝的生长状况。结果表明,融合蛋白为20μg时,立枯丝核菌菌丝生长受到抑制,而且随着融合蛋白量的增加,抑制现象更加明显；且抑菌圈的大小与融合蛋白浓度呈正相关；显微照相结果显示随着蛋白浓度的增加,菌丝的生长减慢,且菌丝密度降低。(7)为进一步分析ZmSCP基因的功能,构建过量表达载体pCAMBIA1301-ZmSCP(启动子为35S)进行烟草转化。实验中共得到抗性植株21株,经基因组PCR、mRNA水平(半定量RT-PCR)和蛋白质(SDS-PAGE)水平分析表明,共获得7株阳性植株,命名为株系1-株系7。通过高浓度卡那抗性对转基因种子发芽率进行分析,统计抗性苗与非抗性苗的比例,结果显示抗性苗与非抗性苗比例约为3：1,初步表明ZmSCP能够在后代稳定遗传和表达。(8)通过对T1代转基因烟草植株抗逆性研究发现,转基因烟草对玉米纹枯病致病菌立枯丝核菌、烟草赤星病病菌、烟草黑径病病菌抗性有不同程度的提高,同时,这些转基因植株中防卫相关基因NtPR1、NtPR2、NtPR3、NtPR5和NtPAL的表达有所增加。另外,转基因植株对非生物胁迫,如干旱、高盐、氧化等均表现出一定的抗性,说明目的基因ZmSCP基因具有广谱抗性,也进一步说明植物抗病反应涉及到多种信号传导途径以及众多蛋白因子的协同作用。