β-1,3-葡聚糖是一种在自然界中广泛存在的高分子多糖,分布于真菌、细菌和植物中,具有多种生物功能。p-1,3-葡聚糖代谢酶系主要包括三种酶：内切p-1,3-葡聚糖酶、外切p-1,3-葡聚糖酶以及β-1,3-糖基转移酶。它们的底物均为β-1,3-葡聚糖,但执行着不同的催化机制,将p-1,3-葡聚糖转化为不同的催化产物,共同参与生物体β-1,3-葡聚糖的循环。本文系统研究了p-1,3-葡聚糖代谢酶系中GH64家族β-1,3-葡聚糖酶、GH17家族p-1,3-葡聚糖基转移酶及GH16家族p-1,3-葡萄糖基转移酶的结构与功能。论文的主要结果如下：(1)从巴伦格兹类芽孢杆菌CAU904中克隆表达得到了一个GH64家族p-1,3-葡聚糖酶(PbBg164A)。该酶是一个典型的GH64家族昆布五糖型p-1,3-葡聚糖酶,水解产物为以昆布五糖为主的一系列混合昆布寡糖,最适反应条件为pH 5.0,70℃C。通过X-射线晶体法解析了PbBg164A及其与昆布六糖的复合物结构。从PbBg164A N-端鉴定出一个新型CBM56家族碳水化合物结合模块,其结构类似于昆虫p-葡聚糖识别蛋白,具有β-1,3-葡聚糖(可得然多糖)结合能力。PbBg164A复合物结构中催化凹槽同时结合了两组寡糖配体,其符合三股螺旋β-1,3-葡聚糖构型。基于结构和催化功能,揭示了GH64家族p-1,3-葡聚糖酶结合三股螺旋p-1,3-葡聚糖及催化产生昆布五糖的分子机制。这一结果也为GH64-TLP-SF超家族蛋白(如奇异果甜蛋白类似蛋白)识别p-1,3-葡聚糖相关研究提供了结构基础。此外,研究了PbBg164A水解可得然多糖制备p-1,3-葡寡糖(昆布寡糖)的水解条件,建立了一套不同聚合度β-1,3-葡寡糖的制备和定量方法。(2)从米黑根毛霉CAU432中克隆表达得到了一个GH17家族p-1,3-葡聚糖基转移酶(RmBgt17A)。RmBgt17A能够催化β-1,3葡聚糖/寡糖底物发生转糖苷反应生成新糖,其最适反应条件为pH4.5,55 ℃。RmBgt17A的整体结构呈现典型的(β/α)8 TIM桶构造,但其缺失GH17家族水解酶催化凹槽末端的亚结构域。残基Tyr135、Tyr136、Glul58和His172的侧链形成空间位阻,将RmBgt17A催化凹槽+2位封闭,使其仅能提供-3至+2五个结合位点。RmBgt17A结构证实了其催化机制：从β-1,3葡聚糖/寡糖还原末端切下二糖,将剩余部分转糖苷连接到另一个p-1,3葡聚糖/寡糖受体上,生成新的β-1,6糖苷键,形成更高聚合度的新糖。基于结构信息对RmBgt17A进行了定点突变改造,成功将RmBgt17A由p-1,3-葡聚糖基转移酶转变成为内切p-1,3-葡聚糖酶,突变体RmBgt17A-E158A完全丧失了转糖苷活性,而其β-1,3-葡聚糖酶活性提升了348.5倍。(3)从嗜热拟青霉J18中克隆表达得到了一个GH16家族p-1,3-葡萄糖基转移酶(PtBgt16A)=该酶能够催化昆布寡糖或纤维寡糖发生转糖苷反应生成更高聚合度寡糖,生成物连接键混合有β-1,3与β-1,4糖苷键。其最适反应条件为pH5.5,60℃。PtBgt16A的结构信息显示其催化凹槽中存在一个隆起的环状结构(loop),其中芳香氨基酸残基Trβ112侧链将催化凹槽阻断形成了口袋构造,仅能提供-1位结合位点。PtBgt16A的结构与功能信息证实其转糖苷反应类似于外切型糖苷水解酶或葡萄糖苷酶的催化形式,即从底物的非还原末端逐一切下一个葡萄糖残基,释放剩余部分,并将该葡萄糖残基转糖苷连接到另一个寡糖上,形成逐渐累加的长链寡糖产物。
