背景与目的卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,全世界范围内每年平均大约有超过200,000名妇女被确诊为卵巢癌患者,死亡人数达120,000之多,其病死率居于妇科肿瘤的首位,严重威胁女性的生命健康。由于卵巢恶性肿瘤位于盆腔深处,所以多数患者早期症状不明显,确诊时约75%的患者已属于晚期,且已发生了腹腔转移。目前,采用卵巢恶性肿瘤细胞减灭术并辅以紫杉醇联合铂类药物进行化疗是国内外公认治疗卵巢癌的标准方案。近年来,卵巢癌病理分期的进一步精确以及外科手术技术的进步使卵巢癌的临床疗效有所提升,但其5年生存率仍不乐观,大多数患者死于复发耐药。另外,以铂类为基础的联合化疗药物,在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了肿瘤周围正常的组织和器官,其毒副作用给患者带来了无法承受的痛苦,以致于难以继续下一疗程。因此,寻求更为有效且无明显毒副作用的抗卵巢癌药物,探索其作用的分子机制具有重要的学术价值和现实的临床意义。白藜芦醇(resveratrol,RV or Res)是一种天然的多酚类化合物,广泛存在于虎杖、葡萄、桑葚、花生等植物中。研究证明,白藜芦醇具抗心血管疾病、抗突变、抗炎、抗氧化、延缓衰老、防治肿瘤、诱导细胞凋亡及保护中枢神经系统等广泛的生物药理学活性。而且,越来越多的实验证明,白藜芦醇能够在膀胱癌、乳腺癌、髓母细胞瘤等多种恶性肿瘤中发挥其抗肿瘤的独特作用。更为重要的是,迄今为止尚未发现白藜芦醇对机体和正常细胞有明显的毒副作用。由此可见,白藜芦醇在肿瘤治疗方面具有较高的药用价值。目前的研究数据也显示,白藜芦醇通过多种途径,发挥其预防和抗肿瘤的作用,如白藜芦醇能使髓母细胞瘤细胞阻滞在s期并明显下调c-myc、cyclinb和cyclind1表达,从而抑制细胞生长诱导其凋亡;它能上调cyp1a1和下调cyp1b1表达,引起wnt、notch、stat3等信号通路的活化状态以及他们下游靶基因表达形式的改变。目前,关于白藜芦醇在卵巢癌中的作用也有报道。然而,有关白藜芦醇抗卵巢癌作用的具体分子机理尚未明确,仍是研究的一大热点。卵巢恶性肿瘤发生发展过程中涉及多条信号转导通路的活化,且其对肿瘤细胞的增殖和存活具有重要的作用。例如,极度活跃的jak/stat3信号通路能够促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。同样有研究显示,wnt信号通路在卵巢癌细胞增殖过程中发挥重要作用,而抑制与卵巢癌细胞相关的notch信号通路,可以增强卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性。亦有资料显示,阻断notch、wnt和stat3信号通路可以抑制多种恶性肿瘤的增殖能力。鉴于以上原因,本实验选择了两个人卵巢癌细胞系,从多角度研究白藜芦醇抗卵巢癌作用的分子机制,明确其作用的主要分子靶点及其抗肿瘤生物学意义,以期能为白藜芦醇在卵巢癌临床治疗中的应用提供科学而可靠的理论依据。具体研究内容包括:(1)探讨白藜芦醇对人卵巢癌细胞的影响,比较不同的人卵巢癌细胞系对白藜芦醇的敏感程度、时间剂量相关性以及对细胞的杀伤性质;(2)分析白藜芦醇处理前后,人卵巢癌细胞中notch、wnt、stat3三条信号通路的活化状态的改变,进一步观察相关信号通路下游靶基因的表达情况的变化。(3)分析三个信号通路的特异性抑制剂对两个细胞系的作用特点,进一步探讨白藜芦醇对卵巢癌作用的关键分子靶点材料与方法选取两个人卵巢癌细胞系caov-3和ovcar-3,分别培养于含有10%胎牛血清的dmem培养基中,和12%胎牛血清的rpmi1640培养基中。将两种人卵巢癌细胞系caov-3和ovcar-3长时间暴露于100μm和120μm白藜芦醇中,每12小时显微镜下观察细胞生长状态的变化,连续观察72小时;通过mtt、tunel染色、he染色、台盼蓝计数及流式细胞仪等方法对白藜芦醇的抗卵巢癌作用进行检测,分析不同培养条件下两种人卵巢癌细胞系对白藜芦醇的敏感程度的变化以及二者对白藜芦醇敏感程度的差异性;采用免疫细胞化学(icc),rt-pcr及western蛋白印迹分析等方法从分子水平检测两种人卵巢癌细胞系经白藜芦醇处理前后,notch、wnt、stat3三条信号通路活化状态的改变,分析探讨下游相关靶基因survivin、c-myc、bcl-2的表达特点。随后,选择notch、wnt、stat3三条通路的特异性抑制剂l-685,458、xav-939、ag490分别处理两种人卵巢癌细胞系caov-3和ovcar-3,采用he染色、mtt及台盼蓝细胞计数等方法检测分析在不同处理条件下,两种人卵巢癌细胞增殖活性的变化,通过免疫细胞化学(icc)分析方法对信号通路中关键分子的检测,探讨三个抑制剂对信号通路的改变情况。实验数据采用spss17.0软件包应用独立样本的t检验和单因素方差检验方法进行分析。结果1.白藜芦醇可有效地抑制卵巢癌细胞的生长,诱导其发生凋亡mtt分析和活细胞计数结果显示,白藜芦醇以时间剂量相关性方式抑制卵巢癌caov-3细胞和ovcar-3细胞的增殖。同时,h/e染色和tunel分析的结果显示,120μm白藜芦醇处理48小时后,这两个卵巢癌细胞系中均存在一定数量的凋亡细胞。另外,流式细胞仪检测的结果也显示,120μm白藜芦醇可以引起卵巢癌细胞发生明显的g1期阻滞。2.白藜芦醇对卵巢癌细胞系中notch、wnt及stat3三条信号通路的作用(1)白藜芦醇对卵巢癌细胞系中notch通路的影响免疫细胞化学结果显示,在两个卵巢癌细胞系中,notch1、notch2及其下游基因hes1均呈阳性表达,主要存在于胞浆中。经120μm白藜芦醇处理48小时后,notch2和hes1在两个卵巢癌细胞系中的表达均有所下降;notch1在后者中表达降低,但是在前者的表达略有升高。westernblotting与rt-pcr的结果,与免疫细胞化学结果相一致。(2)白藜芦醇对卵巢癌细胞系中wnt通路的影响免疫细胞化学结果显示,在两个卵巢癌细胞系中,wnt2在细胞质中均呈阳性表达。在caov-3细胞中的β-catenin呈阳性表达,分布于细胞质和细胞核中;而在ovcar-3细胞中仅在细胞质中存在呈阳性表达的β-catenin。经120μm白藜芦醇处理48小时后,wnt2在caov-3细胞中的表达显著下降,在ovcar-3细胞中略有升高。β-catenin表达下降且出现膜易位现象。e-cadherin在ovcar-3表达增强主要分布于细胞膜上。westernblotting与rt-pcr的结果与免疫细胞化学结果相一致。(3)白藜芦醇对卵巢癌细胞系中stat3通路的影响免疫细胞化学结果显示,在两个卵巢癌细胞系中stat3以及p-stat3均呈阳性表达,分布于细胞质和细胞核中。经120μm白藜芦醇处理48小时后,胞浆和胞质中的stat3以及p-stat3表达均下调,且胞核中p-stat3的表达几乎转为阴性,即无显著的核易位现象。westernblotting与rt-pcr的结果与免疫细胞化学结果相一致。2.白藜芦醇对两个卵巢癌系中notch、wnt及stat3三条信号通路下游基因survivin、c-myc和bcl-2的作用通过icc、westernblotting及rt-pcr等方法对notch、wnt及stat3三条信号转导通路的下游靶基因survivin、c-myc和bcl-2进行检测,结果为这两个人卵巢癌细胞系经120μm白藜芦醇处理48h后,survivin、c-myc和bcl-2的表达水平均有不同程度的下降。westernblotting与rt-pcr的结果与免疫细胞化学结果相一致。3.卵巢癌细胞系caov-3和ovcar-3对三条信号通路特异性抑制剂的敏感性。(1)notch信号通路的特异性抑制剂l-685,458对卵巢癌caov-3细胞和ovcar-3细胞的生长均无影响he染色和mtt结果均显示,8μm的l-685,458处理前后,无论是caov-3细胞还是ovcar-3细胞的细胞形态数量均没有明显改变,这种抑制剂不能诱导卵巢癌细胞产生凋亡。(2)wnt信号通路的抑制剂xav939对卵巢癌caov-3细胞和ovcar-3细胞的生长均无影响he染色和mtt结果均显示,10μm的xav939处理前后,无论是caov-3细胞还是ovcar-3细胞的细胞形态数量均没有明显改变,这种抑制剂不能诱导卵巢癌细胞产生凋亡。(3)stat3信号通路的特异性抑制剂ag490能够抑制卵巢癌caov-3细胞和ovcar-3细胞中p-stat3的表达,从而诱导这两个人卵巢癌细胞系发生凋亡,抑制癌细胞增值。免疫细胞化学结果显示,经80μM的AG490处理48小时,两个卵巢癌细胞系中p-STAT3的表达均显著降低,且在细胞核中的表达转为阴性。其对卵巢癌细胞的抑制效果类似于白藜芦醇,白藜芦醇和AG490对卵巢癌细胞的生长抑制率在CAOV-3细胞中分别为77%和82%;在OVCAR-3细胞中分别为68%和74%。结论1.白藜芦醇对两个人卵巢癌细胞系均有生长抑制作用,诱导细胞凋亡,但与CAOV-3细胞相比,OVCAR-3细胞对白藜芦醇更为敏感,提示不同的卵巢癌细胞系对白藜芦醇的敏感性具有差异性。2.Notch、Wnt和STAT3通路在卵巢癌细胞中共活化;白藜芦醇可抑制它们的活性并伴有三者共享的下游基因Survivn、c-Myc以及Bcl-2的表达下调。因此,白藜芦醇抗卵巢癌作用可能具有多靶点特征。3.白藜芦醇在减少β-catenin核易位的同时,能使其移向胞膜且以OVCAR-3更为显著。这可能是E-cadherin表达和膜上分布增多所致,提示白藜芦醇可诱导细胞分化。4.Notch信号通路特异性抑制剂L-685,458和Wnt信号通路特异性抑制剂XAV939处理后,卵巢癌CAOV-3细胞和OVCAR-3细胞均未出现生长抑制,提示就卵巢癌细胞增殖和生存而言,Notch信号通路和Wnt信号通路的活化与否未必关键。5.STAT3信号通路的特异性抑制剂AG490能够有效抑制卵巢癌CAOV-3细胞和OVCAR-3细胞中p-STAT3的表达,阻断STAT3信号通路的活化,从而抑制其生长。故STAT3信号通路是白藜芦醇作用于卵巢癌的主要分子靶点之一并且该信号通路的活化对人卵巢癌的增殖和生长来说是至关重要的。
