目的：研究三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins, PNS)对顺铂、马兜铃酸肾损害的保护作用,并从蛋白质组学的角度探讨其可能的作用机制,为PNS治疗顺铂肾损害、马兜铃酸肾损害提供理论依据。方法：建立顺铂肾损害、马兜铃酸肾损害的大鼠模型,以及通过培养人肾小管上皮细胞(HK-2)建立体外顺铂肾小管上皮细胞损害模型,并给以PNS进行干预,检测大鼠尿β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(NAG)、24 h尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN),以及肾小管上皮细胞的光密度(OD)；采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)技术筛选各组大鼠肾组织、HK-2细胞的差异表达蛋白质,并利用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱((?)matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry/Mass spectrometry, MALDI-TOF-MS/MS)对部分差异表达蛋白质进行分离鉴定。1、PNS对大鼠顺铂肾损害的保护作用：SD大鼠随机分为正常对照组(d1～d10注射与PNS等容量的生理盐水)、顺铂模型组(d1注射顺铂5mg/kg,d2～d10注射生理盐水)、阳性对照组(d1注射氨磷汀,30min后注射顺铂,d2～d10注射等容量的生理盐水),PNS高、中、低剂量组(d1注射顺铂和高、中、低剂量的PNS,d2～d10注射PNS)。均腹腔注射,每天1次。10d后收集尿液、血液和肾脏组织进行生化检测、电镜检查和差异表达蛋白质的筛选、鉴定。2、PNS对大鼠马兜铃酸肾损害的保护作用：大鼠随机分为空白对照组、马兜铃酸模型组、阳性对照组及PNS低、中、高剂量组(PNSL、PNSM、PNSH)。造模大鼠灌服关木通浸膏,4h后PNS各组灌服不同剂量PNS溶液,阳性组对照组(强的松组)灌服泼尼松3.15mg·kg-1·d-1,马兜铃酸模型组灌服等体积生理盐水。分别于实验第12、16、20w处死大鼠。留取血液、尿液及肾组织标本,检测大鼠24 h尿蛋白含量、尿NAG,以及Scr、BUN的含量。取肾组织作光镜和电镜检查,以及差异表达蛋白质的筛选和鉴定。3、PNS对顺铂损伤HK-2细胞的影响：(1)顺铂、PNS对HK-2细胞增殖的影响。实验分为①顺铂细胞组：细胞在含不同浓度顺铂的培养基中培养；②PNS细胞组：在培养基中加入不同浓度的PNS；③空白细胞组：含10%新生小牛血清。培养48 h。(2)PNS对顺铂抑制HK-2细胞增殖的影响。实验分为①空白细胞组：只含10%新生小牛血清；②顺铂细胞组：顺铂12.5ug/L和10%新生小牛血清；③顺铂PNS细胞组：在含顺铂12.5ug/L的10%新生小牛血清,培养12h后,分别加入不同浓度的PNS。共培养48h。取空白细胞组、顺铂细胞组、顺铂PNS细胞组(含50ug/L PNS),进行差异表达蛋白质筛选、鉴定。结果：1、PNS对大鼠顺铂肾损害的保护作用：①顺铂模型组与正常对照组比较,血清BUN、Scr以及尿的NAG酶均明显升高(P<0.05或P<0.01)PNS各组及氨磷汀组可显著降低上述各指标,其中PNS中剂量组的效果较好。②顺铂模型组大鼠肾小管上皮细胞片状坏死,线粒体明显肿胀,线粒体脊模糊不清或完全消失；PNS各组及氨磷汀组的病理损害有所减轻,正常对照组大鼠无明显病变。③顺铂模型组分别与正常对照组、PNS治疗组的肾组织存在多种差异表达蛋白质。④蛋白质m/z 10815.42被鉴定为线粒体的热休克蛋白,该蛋白质在PNS治疗组大鼠肾组织中高表达,较顺铂模型组表达上调2被以上。蛋白质m/z 16021.67被鉴定为血红蛋白β1亚基和血红蛋白β2亚基,该蛋白质在顺铂模型组中较正常对照组高表达。2、PNS对大鼠马兜铃酸肾损害的保护作用：①马兜铃酸模型组大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白及尿NAG酶均较空白对照组的显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着给药时间延长逐渐加重。PNS各组及强的松组的上述指标均较马兜铃酸模型组的显著下降。②模型组大鼠肾小管肿胀、萎缩及间质纤维化；肾小管上皮细胞线粒体肿胀,吞噬泡及溶酶体增多。PNS治疗组及强的松组的肾小管病变及间质纤维化有所改善,肾小管上皮细胞线粒体肿胀有所减轻。③马兜铃酸模型组分别与空白对照组、PNS20w组、强的松组大鼠之间均存在多个肾组织的差异表达蛋白质。④蛋白质m/z 10082.07被鉴定为乙酰辅酶A结合蛋白,该蛋白质在强的松组大鼠肾组织中高表达,较马兜铃酸模型组的上调2倍以上。⑤在“顺铂肾损害”、“马兜铃酸肾损害”这两部分内容中筛选出5个共同的差异表达蛋白质,说明在这两个药物引起的肾损害的发生或发展过程中可能涉及到一些共同的蛋白质改变；在顺铂肾损害中,PNS可使蛋白质m/z 1428表达下调,而在马兜铃酸肾损害中,PNS却使其上调。具体原因有待进一步研究。3、PNS对顺铂损伤HK-2细胞的影响：①顺铂显著抑制HK-2细胞的增殖,且随着浓度的增加抑制作用越明显；PNS可促进HK-2细胞的增殖,且随着浓度的增大作用越明显。②PNS可减轻顺铂对HK-2细胞增殖的抑制。③暂时未能筛选出差异表达蛋白质。结论：1、三七总皂苷对顺铂肾损害大鼠、顺铂损害HK-2细胞、马兜铃酸肾损害大鼠均有一定的保护作用。2、顺铂模型组分别与正常对照组、PNS治疗组的肾组织存在多种差异表达蛋白质。其中蛋白质m/z 10815.42被鉴定为线粒体的热休克蛋白,该蛋白质在PNS治疗组大鼠肾组织中高表达,较顺铂模型组的上调2倍以上。蛋白质m/z 16021.67被鉴定为血红蛋白β1亚基和血红蛋白β2亚基。这两种蛋白质与顺铂肾损害、PNS保护作用的关系有待进一步的研究。3、马兜铃酸模型组分别与空白对照组、PNS 20w组、强的松组大鼠之间均存在多个肾组织的差异表达蛋白质。其中蛋白质m/z 10082.07被鉴定为乙酰辅酶A结合蛋白,其在马兜铃酸肾损害中的作用有待进一步的研究。4、在“顺铂肾损害”、“马兜铃酸肾损害”这两部分内容中筛选出5个共同的差异表达蛋白质,说明在这两种药物对肾脏的损害过程中可能涉及到一些共同的蛋白质改变。5、差异表达蛋白质有待纯化分离鉴定,才能确定其性质、功能,以及进一步了解它们在顺铂肾损害、马兜铃酸肾损害、PNS干预中所起的作用。6、虽然本课题目前只取得初步的研究结果,但为后续的研究工作提供新的思路和方法,为全面、系统地探讨顺铂肾损害、马兜铃酸肾损害的机制以及PNS的保护作用提供理论基础。
