结核分支杆菌PE/PPE特异性基因的克隆表达及初步应用

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结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌,是当前肆虐全球、严重危害人类健康的重要传染病。随着人口流动增加、多重耐药菌株的出现以及HIV与结核分支杆菌伴发感染,结核分支杆菌的感染和传播呈逐年上升趋势,已成为全球严重的公共卫生和社会问题。早期诊断及规范治疗是主要的防控策略,临床上急需特异而灵敏的的快速诊断方法。PE/PPE蛋白家族随着结核分支杆菌全基因序列测序的完成而发现,推测它们可能具有重要的免疫学价值,有助于研究开发新型特异性诊断试剂和有效的结核疫苗。本研究通过生物信息学分析结核分支杆菌所特有的全部167个PE/PPE,并进行膜蛋白或分泌蛋白的预测,选取与BCG相似性较低的PE/PPE,并结合RD1~RD16区的PE/PPE基因分布及优势抗原表位分析,最终选取三个PE/PPE目的基因作为研究对象,分析具备优势抗原表位的重组蛋白片段可能为结核诊断的研究提供新的备选抗原。成功构建了3个重组表达质粒pET-28a(+)-Rv342519~176、pET-28a(+)-Rv387321~235、pET-28a(+)-Rv2487c421~694,原核表达纯化出具有优势抗原表位的蛋白片段,与rCFP10- ESAT6共同进行主要抗原性分析。重组蛋白的Western印迹分析显示,rRv387321~235、rCFP10-ESAT6与rRv342519~176显示出良好的反应原性;而rRv2487c421~694未检测到阳性条带。ELISA结果显示,rRv342519~176、rRv387321~235和rCFP10-ESAT6在结核抗体检测中的敏感性和特异性分别为39%和97.5%,28%和94.6%, 37%和95%。而将rRv342519~176与rCFP10-ESAT6的ELISA结果合并分析,检测的敏感性可提高到57%,初步显示了rRv342519~176和rCFP10-ESAT6存在一定的抗原互补性,可提高诊断的敏感性并为抗原的联合诊断提供参考。ELISPOT结果显示,rRv2487c421~694和rCFP10-ESAT6检测28例结核病患者阳性率分别为78.6%、75%,检测21例健康者的阳性率分别为19%、23.8%,而rRv387321~235和rRv342519~176均未出现斑点反应。rRv2487421~694作为未见报道的抗原,本试验结果显示其与CFP10-ESAT6的ELISPOT检测结果相近,提示可能作为以T细胞为基础的结核诊断试验的备选抗原。综上所述,本研究通过生物信息学预测的基因抗原表位,为寻找更好的抗原靶位提供了参考。具有优势抗原表位的重组蛋白片段,在结核病诊断中具备一定的潜在应用价值,可与其它备选抗原联合辅助诊断提供参考。
摘要第5-6页
ABSTRACT第6-7页
文献综述第10-20页
    第一章 结核分支杆菌研究进展第10-20页
        1.1 概述第10-11页
        1.2 抗结核疫苗的研究进展第11-12页
            1.2.1 重组减毒株活疫苗第11-12页
            1.2.2 亚单位疫苗第12页
            1.2.3 DNA 疫苗第12页
        1.3 结核诊断技术的研究进展第12-13页
            1.3.1 细菌学检测第12-13页
            1.3.2 血清学诊断方法第13页
            1.3.3 分子生物学诊断方法第13页
        1.4 PE/PPE 蛋白家族研究进展第13-16页
            1.4.1 PE/PPE 蛋白家族的结构特征第13-14页
            1.4.2 PE/PPE 蛋白家族的亚细胞定位第14-15页
            1.4.3 PE/PPE 蛋白家族的生物学功能第15-16页
            1.4.4 PE/PPE 蛋白家族的临床应用第16页
        1.5 结核分支杆菌基因组学研究第16-19页
            1.5.1 生物芯片技术第17-18页
            1.5.2 蛋白质组学研究第18-19页
        1.6 本研究的目的和意义第19-20页
试验研究第20-55页
    第二章 结核分支杆菌标准株H37RV 生物信息学预测第20-33页
        2.1 材料第20页
            2.1.1 基因序列的获取第20页
            2.1.2 应用软件分析第20页
        2.2 方法第20-21页
            2.2.1 提取结核分支杆菌标准株H37Rv 特有的PE/PPE 基因序列第20页
            2.2.2 M.tuberculosis 和M.bovis 序列基因差异区分析第20-21页
            2.2.3 结核分支杆菌膜蛋白及分泌蛋白的预测第21页
            2.2.4 PE/PPE 基因的相似性分析第21页
            2.2.5 选定特异性目的蛋白的抗原表位预测第21页
        2.3 结果第21-31页
            2.3.1 结核分支杆菌标准株H37Rv 特有的PE/PPE 基因序列的提取第21-24页
            2.3.2 M.tuberculosis 和M.bovis 基因差异区分析第24-25页
            2.3.3 结核分支杆菌膜蛋白及分泌蛋白的预测第25-27页
            2.3.4 PE/PPE 基因的相似性分析第27-28页
            2.3.5 特异性目的蛋白的抗原表位预测第28-31页
        2.4 讨论第31-32页
        2.5 小结第32-33页
    第三章 结核分支杆菌PE/PPE 基因的克隆表达及初步应用第33-55页
        3.1 材料第33-38页
            3.1.1 菌株与质粒第33页
            3.1.2 血清及新鲜全血第33页
            3.1.3 主要试剂第33-34页
            3.1.4 主要仪器第34-35页
            3.1.5 主要溶液的配制第35-38页
        3.2 方法第38-46页
            3.2.1 基因克隆第38-42页
            3.2.2 目的蛋白的表达和纯化第42-44页
            3.2.3 重组蛋白的Western 印迹分析第44页
            3.2.4 重组蛋白的免疫学检测第44-46页
        3.3 结果第46-52页
            3.3.1 目的基因扩增第46-47页
            3.3.2 重组质粒pMD-18T 的PCR 双酶切鉴定第47页
            3.3.3 重组蛋白的诱导表达与纯化第47-49页
            3.3.4 重组蛋白的Western 印迹分析第49-50页
            3.3.5 ELISA 体液免疫价值评价第50-52页
            3.3.6 重组蛋白的ELISPOT 分析第52页
        3.4 讨论第52-53页
        3.5 小结第53-55页
结论第55-56页
参考文献第56-60页
缩略词表第60-61页
致谢第61-62页
作者简介第62页
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