大肠杆菌0157：H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)中最具代表性的血清型,能引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症或血栓形成性血小板减少性紫癜等疾病,该菌已在世界范围内引起感染流行。因此,探索建立能适用于现场或基层的灵敏度高、特异性强的检测方法,对于该菌的防控具有重要意义。免疫层析方法以其检测快速、操作简便、灵敏度高等特点成为该菌筛查中的常用方法。标记物的选取在免疫层析技术中至关重要,目前,胶体金的应用最为广泛。本研究在大量的前期工作基础上,比较了纳米荧光微球和胶体金作为标记物偶联抗大肠杆菌0157：H7单克隆抗体的偶联率,制备了基于双抗体夹心原理的荧光微球微球试纸条(FM-ICTS)和胶体金试纸条(CG-ICTS),首次对抗体与标记物的偶联规律对免疫层析方法的影响进行了深入细致的比对研究。单抗与荧光微球的偶联率随着抗体投入量的增加而降低,但是偶联到微球表面的抗体量却不断增加,当抗体与荧光微球的比例达到100μg/mg时,层析方法的灵敏度不会再随抗体标记量增加而提高；单抗与胶体金的偶联率并未随抗体投入量的增加呈现规律性变化,当抗体与胶体金的比例达到10μg/mL时,增加抗体的投入量也不会提高试纸条灵敏度。最终结果显示,FM-ICTS的灵敏度为9.6x103CFU/mL,要民CG-ICTS的灵敏度高约5倍,每张FM-ICTS消耗的单抗量为0.1μg,而每张CG-ICTS消耗的单抗量为0.4μg,所以在该检测体系中,从检测灵敏度和抗体使用量角度比较,荧光微球更具优势。当菌液浓度高于106CFU/mL后,检测线(T线)出现信号降低的趋势,出现免疫层析中较少报道的HOOK效应,印证了层析反应也遵从ELISA免疫反应规律,此效应在FM-ICTS和CG-ICTS现象一致。免疫磁性分离技术(IMS)已广泛应用于致病菌的分离中,本研究IMS与FM-ICTS相结合,成功的应用于生牛乳中大肠杆菌0157：H7的检测。1mL纯培养大肠杆菌0157：H7肉汤体系,用IMS富集浓缩10倍后用于FM-ICTS检测,能明显缩短60min预增菌时间。接种量为0.5、2CFU/g的生牛乳,选择性增菌后用FM-ICTS检测,分别至少需要培养11、9h才能检出阳性信号,而用免疫磁分离结合FM-ICTS的方法只需9、7h即可检测阳性信号,IMS能消除生牛乳增菌肉汤基质的影响,提高检测灵敏性。
