碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及同源性分析

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目的:探讨临床分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药机制及同源性。方法:收集南昌地区四家教学医院耐碳青霉烯类抗生素(亚胺培南和/或美罗培南)的肺炎克雷伯菌29株,双纸片增效法检测ESBLs(超广谱β-内酰胺酶)、三维实验检测AmpC酶、改良Hodge实验和双纸片协同法检测碳青霉烯酶,聚合酶链反应(PCR)扩增耐药基因,并对扩增产物测序,确定其基因型。接合试验评价耐药质粒的可转移性。脉冲场凝胶电泳(PFGE)对其进行同源性分析。采用多位点序列分型技术(MLST)对CRKP进行分子遗传学分析,应用eBURST软件对多位点序列分型结果进行其种群结构分析。结果:29株实验菌中有19株携带碳青霉烯酶基因,占65.5%(19/29),以blaKPC-2为主(44.8%,13/29),其次为blaNDM-1、blaIPM-26及blaIPM-4,携带率分别为17.2%、10.3%及6.9%,另还有3株同时携带blaKPC-2和blaIPM-26,1株同时携带blaKPC-2和blaIPM-4。17株除携带碳青霉烯酶基因外,还携带ESBLs基因和(或)AmpC基因,占58.6%。未检测到VIM、GES、SPM及OXA等其他碳青霉烯酶基因。PMQR(质粒介导的喹诺酮类耐药基因)检出率为48.3%(14/29),其中qnrB5株,包括qnrB21株、qnrB43株、qnrB101株;qnrS5株,均为qnrS1;1株同时携带qnrS1和qnrB4;aac(6’)-Ib-cr3株。8株16S rRNA甲基化酶基因阳性,其中7株armA阳性,1株rmtB阳性。KP25外膜蛋白基因Ompk35缺失,其他实验株Ompk35、Ompk36均未缺失。29株实验菌中有27株被PFGE成功分型,分别属于20个不同克隆,其余2株分型不成功,属于同一克隆型且携带blaKPC-2基因的4株菌来源同一医院。29株CRKP被MLST成功分成16个ST型,以ST11和ST15为主(各5株),其次ST395(3株),ST334、ST273、ST147(各2株,),ST1128、ST42、ST1031、ST764、ST629和ST37(各1株),另有4个新的ST型已被Pubmlst数据库确认收录并分别命名为ST1369、ST1411、ST1412和ST1413。29株实验菌对阿米卡星的耐药率较低外(37.9%),对其他15种测试抗菌药物的耐药率均大于69%,其中对头孢呋辛、亚胺培南的耐药率为100%,多重耐药肺炎克雷伯菌的检出率为62.1%(18/29)。结论:CRKP耐药及多重耐药性严重,通过29株实验菌对临床常用的16种测试抗菌药物耐药率的筛选,结果显示阿米卡星的耐药率最低(37.9%),提示临床可以把阿米卡星选为治疗CRKP感染最有效的抗生素。携带碳青霉烯酶基因是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素的主要原因65.5%(19/29),以blaKPC-2为主(44.8%,13/29);尤为明显的是29株CRKP中有5株携带blaNDM,明显高于国内其他地区,而且有17株除携带碳青霉烯酶基因外,还携带ESBLs基因、AmpC基因、PMQR基因、16S rRNA甲基化酶基因等,可见CRKP耐药机制的复杂。本地区CRKP具有基因多态性,主要克隆系为ST11和ST15,曾有过短暂局部的ST15流行;另外4个新的ST型已被Pubmlst数据库确认收录并分别命名为ST1369、ST1411、ST1412和ST1413。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
中英文缩写词表第9-11页
第1章 引言第11-13页
第2章 材料与方法第13-24页
    2.1 材料第13页
        2.1.1 菌株来源第13页
        2.1.2 主要仪器和试剂第13页
    2.2 方法第13-24页
        2.2.1 实验主要试剂的配制第13-14页
        2.2.2 引物设计与合成第14-17页
        2.2.3 药敏试验第17页
        2.2.4 ESBLs 检测第17页
        2.2.5 改良 Hodge 实验第17页
        2.2.6 金属β-内酰胺酶检测(EDTA 协同试验)第17页
        2.2.7 三维试验检测 AmpC 酶第17-18页
        2.2.8 接合实验第18页
        2.2.9 耐药基因 PCR 扩增及序列分析第18页
        2.2.10 脉冲场凝胶电泳(PFGE)第18-22页
        2.2.11 多位点序列分型(MLST)第22-24页
第3章 结果第24-37页
    3.1 菌株来源第24-25页
    3.2 药物敏感性试验结果第25-26页
    3.3 ESBLs 检测第26页
    3.4 改良 Hodge 试验第26-27页
    3.5 EDTA 协同试验测金属酶第27页
    3.6 三维试验第27-28页
    3.7 接合试验第28页
    3.8 耐药基因的 PCR 检测及测序结果第28-32页
    3.9 脉冲场凝胶电泳(PFGE)第32-33页
    3.10 多位点序列分型(MLST)第33-37页
第4章 讨论第37-41页
第5章 结论第41-42页
致谢第42-43页
参考文献第43-46页
攻读学位期间的研究成果第46-47页
综述第47-53页
    参考文献第52-53页
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