mTOR信号通路中上游调控蛋白Rheb&FKBP38在脂肪细胞分化中的作用

Rheb(Ras homolog enriched in brain)是小G蛋白Ras的同源蛋白，在功能上具有相似性，即具有GTP酶的活性。Rheb在体内有两种存在方式，与GDP结合的方式（GDP-Rheb）和与GTP结合的方式（GTP-Rheb），后者才具有相应的生物学活性。Rheb可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）来调控多种生物学活动，比如存活、生长、增殖、再生、能量代谢、氧化应激等。然而最近有研究报道称，mTOR被过度激活后，可以抑制脂肪分解、促进脂肪生成和储存，而抑制mTOR活性后，可以明显减低体脂含量并抵抗高脂饮食诱导的肥胖。因为Rheb是mTOR上游的调节蛋白，并且通过mTOR来实现其功能，所以我们想阐明在mTOR调节脂肪生成的过程中，Rheb是否也同样起到了调节作用。为此我们构建了Rheb的重组质粒（pCAG-Insulator-Rheb），并将其注射到B6小鼠的胚胎内，产生全身高表达Rheb的转基因小鼠。然后提取转基因阳性小鼠的胚胎成纤维细胞（mouse embryonicfibroblast cells, MEFs），进行诱导分化。然后通过检测MEFs内甘油三酯的含量、检测脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达情况，来观察Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用。在本实验中，我们观察到高表达Rheb后，可以促进MEFs内脂滴的生成，甘油三酯含量明显增高，油红O染色（Oil Red O Stain）有明显区别，并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均明显升高。由此，我们得出结论：Rheb过表达以后确实可以促进脂肪细胞的分化。而Rheb促进脂肪细胞分化的作用也很可能是通过过度激活mTOR来实现的，进一步观察mTOR下游的靶蛋白如S6K、S6的磷酸化表达水平可能为这一现象提供合理的解释。该实验为进一步阐明脂肪细胞分化的调控机制提供新的理论，同时给临床防治肥胖带来新的契机。在体内，FKBP38可以与mTOR直接结合起到抑制mTOR活性的作用，这个效果类似于Rapamycin-FKBP12复合物的作用，因此FKBP38被认为是mTOR的内源性抑制剂，其活性不需要辅助条件的参与。然而，FKBP38又同时能与GTP-Rheb结合，从而释放其对mTOR的抑制作用。但是对于FKBP38对mTOR的调控作用，目前并没有达到统一的认识，甚至得出了相反的结论。氨基酸作为经典的mTOR激活剂，似乎并没有参与FKBP38对mTOR活性的调节。但由于在mTOR信号通路中，FKBP38所在的位置特殊，在Rheb的下游、mTOR的上游，因此进一步了解FKBP38的生理功能也具有极为重要的意义。为此我们同样构建了FKBP38的重组质粒（pCAG-Insulator-FKBP38），并注射进B6小鼠胚胎产生全身高表达FKBP38的小鼠，进行成脂诱导分化，观察其在脂肪分化中所具有的调控作用。结果，与Rheb促进脂肪分化的效应相反，FKBP38过表达可以抑制脂肪细胞的分化。但其具体的调控机制还有待进一步实验证明。目的:（1）观察mTOR信号通路中上游调控蛋白Rheb对脂肪细胞分化的影响（2）观察mTOR信号通路中上游调控蛋白FKBP38对脂肪细胞分化的影响方法：（1）构建Rheb和FKBP38重组质粒并进行胚胎注射产生全身高表达的转基因小鼠。（2）用聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）法鉴定转基因小鼠的阴阳性和Rheb/FKBP38表达量高低。（3）提取转基因小鼠第13.5天胚胎成纤维细胞（MEFs）进行诱导分化。（4）在分化第12天进行油红O染色（Oil Red O），并测定细胞内甘油三酯的含量，再用实时定量PCR（Real Time-PCR）方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达情况。结果：（1）高表达Rheb后，可以促进MEFs内脂滴的生成，甘油三酯含量明显增高（P<0.05），油红O染色（Oil Red O Stain）有明显区别，并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均明显升高（P<0.05）。（2）高表达FKBP38后，可以抑制MEFs内脂滴的生成，甘油三酯含量明显降低（P<0.05），油红O染色（Oil Red O Stain）有明显区别，并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均明显降低（P<0.05）。结论：（1）Rheb可以促进脂肪细胞的分化。（2）FKBP38可以抑制脂肪细胞的分化。