应用蛋白质组学方法研究小鼠Cyclin B1反义全长cDNA抑制肿瘤增殖的分子机制

背景与目的：肿瘤的发生和发展是一个多因素、多阶段、多基因变异累积的复杂过程，造成肿瘤细胞无限增殖的原因和机制非常复杂，而其中一个重要原因就是细胞周期的失控。细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）为有丝分裂期细胞周期蛋白，与细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）结合形成促有丝分裂因子（MPF）而调控细胞周期。它在许多肿瘤细胞系均为高表达，与肿瘤的发生、分化、转移和预后等因素有关，被视为肿瘤具有恶性潜能的标志之一。我室先前应用全长反义cDNA技术靶向小鼠Cyclin B1，发现其可以降低Cyclin B1基因表达水平，诱导细胞发生G1期阻滞及凋亡，从而抑制肿瘤细胞体内，外增殖活性等，但对其抑瘤机制尚未进行深入探讨。而既往其它的一些研究对此涉及也较少，且多局限于核酸分子或个别蛋白质水平。蛋白质组学可以从整体、动态水平上大规模、高通量地研究蛋白质的分子组成及相互作用规律等，为探讨肿瘤的发生发展及致病机理等提供了一种有力手段。本研究旨在利用比较蛋白质组学方法来探讨小鼠Cyclin B1反义全长cDNA抑制肿瘤增殖的分子机制。方法：首先用含有小鼠Cyclin B1反义全长cDNA的重组质粒（pAS-mCLB1）及pcDNA3.1（+）空质粒分别转染小鼠CT26结肠癌细胞株，建立AS-mCLB1及pcDNA3.1（+）稳定转染子（Ac及Pc细胞）。通过MTT及细胞生长实验检测Ac、Pc及未转染组（Nc细胞）的细胞增殖活性，并用流式细胞仪检测它们的细胞周期分布及凋亡。然后用双向凝胶电泳（2-DE）及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分离鉴定Ac组与两对照组间的差异蛋白，并对其中的部分差异蛋白，用RT-PCR及Western blot在mRNA和蛋白质水平进行验证。最后将三组细胞分别接种于BALB／c小鼠体内，观察细胞在体内的成瘤性及荷瘤小鼠的生存时间，并用HE染色和原位末端标记（TUNEL）法检测两组细胞的血管生成及细胞凋亡差异等。结果：Ac细胞与两对照（Nc及Pc）细胞相比，出现明显的细胞增殖受抑、G1期阻滞及细胞凋亡。利用比较蛋白质组学方法初步鉴定出25个差异蛋白，其中10个表达上调，15个表达下调。它们分别与细胞凋亡、癌基因失活、血管生成、转录调控及信号转导等有关，并对其中的6个差异蛋白在mRNA和蛋白质水平进行了验证。在动物实验中，接种CT26／Ac细胞的BALB／C小鼠在接种后第12天成瘤，而两对照组分别于第5、6天就已成瘤，而且实验组小鼠的生存时间比两对照组明显延长。HE染色及凋亡染色显示在实验组血管生成减少，凋亡细胞增加。结论：本研究证实了小鼠Cyclin B1反义全长cDNA通过降低肿瘤细胞内Cyclin B1基因表达，可诱导细胞发生G1期阻滞及凋亡，从而抑制肿瘤细胞体内外增殖活性。蛋白质组学方法显示多种蛋白质表达在实验组及两对照组间存在明显差异，这些差异蛋白与细胞凋亡、癌基因失活、血管生成、转录调控及信号转导等密切相关，提示其抑制肿瘤增殖的分子机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，阻滞肿瘤细胞周期，影响Cyclin B1或其它信号转导通路中的相关分子表达，抑制癌蛋白表达，影响转录分子活性及破坏细胞骨架蛋白等多种因素有关。