[目的]1)在整体水平观察小鼠MCMV感染后脾巨噬细胞内AIM2炎性体各组分蛋白及其下游促炎因子IL-1β和IL-18的时序性表达变化,证实AIM2对MCMV DNA的识别并探讨其炎性体通路在抗MCMV天然免疫与获得性免疫机制中的作用；2)在整体水平观察MCMV播散性感染急性期脾Th17细胞的分化及其细胞因子IL-17A在不同脏器内的表达变化,分析Th17细胞和IL-17A表达与MCMV载量及脾和唾液腺病理改变的相关性,探讨Th17细胞在急性播散性MCMV感染致病机制中的作用。[方法]1)建立动物模型：45只4.5周龄BALB/c小鼠,腹腔接种(5×103)PFU MCMV Smith株,建立播散性感染模型,另45只小鼠模拟感染做为对照。于病毒接种后3 d、7 d、14 d、28d(急性期末)和45 d,收集小鼠静脉血和无菌分离脾、唾液腺、肝和肺组织。为获取足够的脾巨噬细胞和血清样本量,各组每个时间点随机抽取3只小鼠为1小组,其静脉血予以混合,脾脏各取2/3加以混合富集巨噬细胞,其余组织样本随机抽取3份,故每个时间点的样本数为3；2)AIM2炎性体通路蛋白表达：分离小鼠脾脏中巨噬细胞,提取蛋白,用Western blot法检测AIM2炎性体通路蛋白包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和(?)caspase-1的表达强度,设GAPDH为内参蛋白,以各目的蛋白与GAPDH蛋白积分光密度比值(K值)进行半定量分析；3)血清IL-1p和IL-18水平：用双抗体夹心ELISA法检测血清中AIM2炎性体通路下游细胞因子IL-1β和IL-18水平的变化；4)优化Th17细胞分化诱导方案：分离3只正常小鼠的脾脏淋巴细胞；分别应用无刺激、灭活MCMV、PMA/Ionomycin、灭活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法；在脾脏淋巴细胞培养刺激不同时间后,采用流式细胞术检测(?)CD3+CD4+IL-17A+细胞比率；并用双抗体夹心ELISA法检测培养上清中IL-17A蛋白浓度,观察分析不同方法诱导Th17细胞分化的效应,选择最佳的分化诱导方法；5)脾Th17细胞比率和病毒特异性IL-17A表达水平：取急性期阶段即感染后3d、7d、14d和28d的脾组织,分离脾脏淋巴细胞。采用灭活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法诱导Th17细胞分化,用流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中CD3+CD4+IL-17A+细胞比率。用双抗体夹心ELISA法检测培养上清中IL-17A浓度时,设立单独PMA/Ionomycin刺激组作为基础刺激对照,计算灭活MCMV/PMA/Ionomycin刺激和单独PMA/Ionomycin刺激脾淋巴细胞培养上清中IL-17A浓度之差值来评估病毒特异性IL-17A表达水平。对比分析两组之间的差异;6)不同脏器组织中IL-17A蛋白表达：用免疫组织化学染色法检测急性期试验小鼠脾、唾液腺、肝、肺组织中IL-17A蛋白的表达分布情况,对比分析不同脏器组织的局部免疫特征；7)脾和唾液腺病理变化：取脾和唾液腺组织切片行HE染色,半定量评估急性期试验小鼠脾和唾液腺组织的病理变化；8) MCMV病毒载量：用标准空斑试验检测急性期各脏器组织内感染性病毒滴度；9)相关性分析：对脾细胞培养上清中病毒特异性IL-17A和组织中IL-17A蛋白表达水平与脾和唾液腺组织病理损伤程度及病毒载量进行相关性分析。[结果]1) AIM2炎性体通路蛋白表达：MCMV感染后的脾巨噬细胞提取蛋白中,AIM2炎性体通路各组分包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表达呈现一致性变化,均在感染后3d(感染早期)显著升高达峰值,与模拟感染对照组相比差异有统计学意义,K值分别为(1.120±0.243)vs(0.230±0.046)；(1.318±0.333)vs(0.248±0.090)；(2.049±0.401)vs(0.390士0.120)；(1.483±0.420)vs(0.176±0.045),均P<0.01；其后表达均下降,与对照组水平相当；2)血清IL-1p和IL-18水平：MCMV感染组血清IL-1β和IL-18浓度于感染后3d明显高于模拟感染对照组,IL-1β浓度为(111.050±28.500)vs(55.858±2.983)pg/ml,P<0.05；IL-18浓度达(99.911±2.222)vs(57.206±6.228)pg/ml,P<0.01；3)优化Th17细胞分化诱导方法：无刺激组和灭活MCMV刺激组均不能有效诱导Th17细胞表达。与应用相同方法培养刺激1 d+6 h组及应用PMA/Ionomycin培养刺激6h组相比,灭活MCMV+PMA/Ionomycin培养刺激6h组能够有效诱导Th17细胞分化[Th17细胞比率分别为(0.163±0.035)vs(0.083±0.032)%,P<0.05；(0.163±0.035)vs(0.033±0.015)%,P<0.01]；同时,脾淋巴细胞培养上清中IL-17A浓度也明显升高[分别为(67.246±4.578)vs(45.317±8.793)pg/ml,P<0.05；(67.246±4.578)vs(24.474±5.134)pg/ml,P<0.01]；4)脾Th17细胞比率和病毒特异性IL-17A表达水平：MCMV感染后3d,7d,14d,28d,小鼠脾淋巴细胞体外经优化方法诱导分化,Th17细胞比率均高于模拟感染对照组[分别为(0.67±0.13)vs(0.22±0.02)%,P=0.004；(0.82±0.02)vs(0.18±0.06)%,P=0.004；(1.14±0.09)vS(0.19±0.04)%,P=0.000；(0.47±0.11)vs(0.20±0.06)%,P=0.017]。MCMV感染组脾淋巴细胞培养上清中病毒特异性IL-17A蛋白浓度在感染后3、7 d虽有升高,但与模拟感染对照组相比无统计学差异(P>0.05)；而感染后14d达峰值,明显高于对照组[(81.98±12.37)vs(44.96±8.44)pg/ml,P<0.01]；至感染后28 d虽有下降,但仍高于对照组[(57.58±8.14)vs(35.10±10.41)pg/ml,P<0.05]；5)不同脏器组织中IL-17A蛋白表达：MCMV感染鼠的肝、肺组织中仅于感染后3d可见少量IL-17A+细胞；脾和唾液腺组织中可见明显增多的IL-17A+细胞,并于感染后14d达峰值,且部分唾液腺分泌管上皮细胞也表达IL-17A；6)脾和唾液腺病理变化：MCMV感染后14d脾组织病理损伤程度最重：白髓结构明显破坏,可见大量吞噬细胞、出血坏死及纤维条索增生；MCMV感染后14d唾液腺组织病理损伤程度也最严重：出现大量炎性浸润灶,组织结构明显破坏；7) MCMV病毒滴度：肝和脾组织病毒滴度于感染后3d升高,其后迅速下降,14d检测不到；肺组织病毒滴度低于检测低限,而唾液腺组织病毒滴度呈逐渐增高趋势,于感染后14d达峰值；8)相关性分析：脾淋巴细胞培养上清中病毒特异性IL-17A蛋白浓度与唾液腺组织病毒滴度呈正相关(r=0.74,P<0.01)；脾和唾液腺组织病理损伤越重,脾细胞培养上清中病毒特异性IL-17A蛋白浓度越高(r=0.78,P<0.01)；唾液腺组织内的IL-17A蛋白表达与MCMV滴度变化呈正相关(r=0.63,P<0.05),并与脾和唾液腺组织病理损伤程度也呈正相关(r=0.68,P<0.01)。[结论]1)在MCMV感染早期,小鼠脾巨噬细胞AIM2感受器能够识别胞内MCMV DNA;AIM2炎性体参与MCMV感染早期的抗病毒天然免疫应答；同时,通过其下游细胞因子IL-1β和IL-18在启动获得性免疫应答过程中发挥重要作用。2) MCMV感染急性期IL-17A蛋白表达呈现明显组织差异性分布,其在唾液腺中高表达的局部免疫特征可能是MCMV(?)能够在唾液腺中长期持续复制的关键免疫因素之一；Th17细胞可能通过IL-17A参与MCMV持续性感染及组织免疫病理损伤机制。
