研究背景线粒体作为一种极其重要的细胞器,参与了细胞内的ATP生成,钙离子浓度的维持以及细胞凋亡等过程。而在神经元中,将线粒体准确运输到突触部位,对于调控突触前的递质释放,突触后的离子转运以及树突棘的形成都有重要的意义。前人对线粒体运动机制的研究发现,驱动蛋白Kinesin家族成员KIF5A/B/C, KIF1Bα和KLP6等,参与了线粒体沿着轴突的顺向运输。而除了对相关驱动蛋白的研究外,对于调控线粒体运动的细胞内信号分子的报道也有很多,例如,NGF可以通过激活下游的P13K从而调控线粒体运输；五羟色胺和多巴胺可以激活Akt-GSK3β信号通路影响线粒体运输；钙离子也可以作为一种第二信使调控线粒体运输。最近的研究发现,KIF5, Milton和Miro1可以组成复合体介导线粒体沿着微管的运输,而在这个复合体中Miro1起了钙离子感受器的作用。脑源性神经营养因子(BDNF)作为一种广泛表达在中枢神经系统中的神经营养因子,在调控神经元的生长、发育以及突触的可塑性中发挥着重要作用。BDNF的功能由两个受体介导,TrkB受体和P75受体,下游还有MAPK、PI3K和PLCγ等分子来传递细胞内信号。据报道,BDNF可以调控脑内的线粒体代谢,从而调控ATP的生成。但是,BDNF是通过何种机制来调控线粒体的运输从而影响其功能的,却仍然不清楚。本实验利用活细胞成像技术以及线粒体分离技术,研究BDNF对于线粒体运动的影响,并进一步探讨线粒体的运动在BDNF的生物学功能中的所起的作用,研究结果如下：1. BDNF刺激神经元使突起中运动线粒体比例减少我们运用活细胞成像技术和脂质体转染技术观察线粒体运动情况。发现BDNF短时间(15分钟)处理神经元,可以显著减少顺轴突和逆轴突运动的线粒体的比例。为了检测BDNF对于线粒体运动影响的特异性,我们又用GFP标记的Rab5来显示内体,发现内体的运动不受BDNF调控,说明BDNF特异性的影响线粒体的运动。有研究表明, BDNF可以增加线粒体的氧化磷酸化以及ATP的生成。但我们发现短时间的BDNF处理没有影响线粒体的膜电位以及ATP的生成。说明线粒体的运动状态改变是在功能改变之前发生的。2. BDNF引起的运动中线粒体比例降低需要激活P13K和PLCγ由于发现了BDNF促进神经元中线粒体运动停止这一现象,后续实验旨在研究这一现象的具体机制。我们通过使用激酶抑制剂阻断信号通路,发现BDNF引发的线粒体运动停止依赖于TrkB-PI3K和TrkB-PLC γ-IP3R信号通路。3.细胞内钙离子的上调是BDNF引发线粒体运动停止的必要条件前面发现的两条信号通路都可以调控BDNF引起的钙离子浓度变化,而钙离子是线粒体运动重要的调节因子。因此我们使用了胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和胞外钙离子螯合剂EGTA,发现都可以阻碍BDNF引发的线粒体运动停止。研究发现,TRPC通道对钙离子有透过性并且可以被BDNF激活,因此我们使用TRPC通道抑制剂SKF-96365,并检测线粒体运动,发现BDNF对于线粒体运动的调控被完全阻断了。说明TRPC介导了BDNF引起的线粒体运动停止。4.Miro1参与调节BDNF诱导的线粒体运动停止上述研究阐明了钙离子调控了线粒体的运动停止,接下来我们探讨钙离子通过何种途径来实现这个过程。有研究表明线粒体外膜蛋白Miro1可作为钙离子浓度感受器调节线粒体的运动。我们通过基因突变的方式,将野生型或突变型Miro1(突变蛋白命名为Miro1KK,其EF结构域发生突变从而失去钙离子结合能力)转染进海马神经元中,检测线粒体运动,发现在表达Miro1KK的神经元中,BDNF无法引起线粒体运动停止。上述结果表明Miro1可能通过与钙离子结合介导了BDNF引发的线粒体运动停止。5. BDNF引起的线粒体运动停止有利于BDNF促进突触传递由于线粒体能够为神经元的正常功能,特别是突触可塑性,提供能量和调控钙离子浓度。接下来我们要检测BDNF引发的线粒体运动停止是否促进线粒体在突触处的聚集。通过免疫荧光共定位实验,发现BDNF处理的神经元中,线粒体与SV2共定位显著增加,并且受到Miro1KK突变体影响。我们用FM1-43荧光染色检测BDNF增强囊泡释放的过程。实验结果表明BDNF确实可以促进轴突末梢囊泡的释放,而这一增强作用在Miro1KK突变体转染的神经元中受到了抑制,这表明线粒体在突触部位的聚集参与BDNF调控的神经递质释放。结论1.BDNF处理神经元使突起中运动线粒体比例减少2.Miro1通过与钙离子结合参与调节BDNF诱导的线粒体运动停止3.BDNF引发的线粒体运动停止有利于BDNF促进突触递质释放
