睾丸间质干细胞(stem Leydig cells,SLCs)是雄性动物睾丸中的一类成体干细胞,可定向分化为成熟睾丸间质细胞(adult Leydig cells,ALCs),调控精子发生。猪作为重要的经济动物和理想的哺乳动物模型,可代替小鼠等模式动物在辅助生殖领域发挥重要作用,然而此前并无猪SLCs的相关研究报道。因此,本研究以不同时期猪睾丸为研究对象,利用H&E染色、免疫组织化学和qRT-PCR等生物技术手段,旨在鉴定并分离猪SLCs,并探究其体外培养体系,为后续进一步研究其增殖分化调控的机制提供基础。本研究获得如下重要研究结果:1.猪SLCs的组织学鉴定PDGFRα+细胞主要分布在猪睾丸曲细精管管周和间质部分,部分为纺锤形,证明SLCs在猪睾丸中是存在的。PDGFRα+细胞在7 d睾丸间质中所占比例显著高于2 m睾丸间质中。同时,Nestin在7 d猪睾丸的mRNA表达量高于2 m猪的表达量,而CYP17A1在2 m猪睾丸的表达量最高,表明:相比于2 m与成年猪睾丸,7 d猪是分离SLCs最适宜的采样时间点。2.猪原代SLCs的分离与鉴定本研究采用胶原酶消化法分离得到7 d猪睾丸间质中的原代细胞。发现该原代细胞表达SLCs和干细胞的分子标记(Nestin、PDGFRα、Oct4和LIFR),但不表达精原干细胞的分子标记(PLZF)和支持细胞的分子标记(SOX9),提示本研究采用的分离方法可有效除去曲细精管内细胞。随后,LIFR和PDGFRα在原代细胞中的表达量显著高于在7 d猪睾丸组织的表达量,表明本研究可分离和富集猪SLCs。1.00 mg/mL EDS处理发现该原代细胞含约23.3%的已分化LCs。3.猪原代SLCs的体外短期培养本研究将猪睾丸组织液(porcine testicular fluid,pTF)添加在培养基中,以期实现对猪SLCs的体外培养。结果发现,在添加pTF的情况下,原代SLCs培养1周后,有细胞克隆形成,且形成克隆的细胞表达PDGFRα。而在不添加pTF的情况下,无细胞克隆形成,且这些细胞表达CY17A1,提示SLCs在普通培养条件下已自发分化成LCs。以上结果说明,添加pTF有助于SLCs的干细胞特性的维持,并可在体外进行短期培养。综上,本研究成功鉴定并分离出了猪SLCs,且pTF对猪SLCs干细胞特性的维持有支持作用,并以此为基础,建立了猪SLCs的体外短期培养体系。这些研究结果为进一步研究猪SLCs的增殖分化调控机制奠定了基础,为人SLCs的分离与培养研究积累了科学资料。
