1、促肾上腺皮质激素释放激素对海马突触发育的调节作用 2、糖皮质激素作用于G蛋白耦联相关受体对海马神经元NMDA受体的快速作用

应激指机体对内外环境刺激因素所做出的适应性反应的过程。过度应激可引起机体下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴持续激活，神经内分泌系统紊乱，并造成中枢神经系统（CNS），尤其是海马的器质性损害和功能异常。海马是HPA轴的高级调节中枢之一，且与行为活动和学习记忆等密切相关。海马既是应激反应的调控中心，也是应激损伤的敏感区域。应激引起海马损害的机制十分复杂。促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）是下丘脑室分泌的多肽类激素，被视为应激反应中调节HPA轴活动的中枢驱动因子。CRH的主要作用是调节垂体促肾上腺皮质激素（ACTH）的释放。近年来的研究表明，CRH不仅在下丘脑有表达，在中枢神经系统其它区域也有表达。CRH受体在脑内也有广泛的分布，表明CRH可作为一种广泛分布于CNS的神经递质或者调制，在情绪反应、学习记忆以及神经系统的发育中也发挥着重要作用。海马脑区接受来自下丘脑以及其他脑区的CRH神经纤维投射，且表达CRH两型受体，提示海马是CRH作用的重要靶区。研究证实，CRH可以调节海马神经元树突和树突棘的发育，进而影响海马依赖性学习和记忆能力。糖皮质激素（GC）是肾上腺皮质分泌的重要激素，参与机体各个系统的物质代谢，组织器官的发育成熟。GC分泌增多被视为应激反应的重要特征之一。应激刺激选择性损伤海马脑区与该区域富含GC受体密切相关。NMDA受体是参与海马功能活动的一类重要的离子通道型受体，是突触可塑性以及学习记忆的必要结构基础。研究证实，GC对海马神经元上NMDA受体具有精细的调节作用，并进而影响海马的结构和功能。在应激反应中，作为中枢介质的CRH和外周介质的GC对海马神经元的形态结构及海马依赖性相关功能的调节作用及其机制尚未得到确切阐明。因此，本课题分为两个部分探讨了CRH和GC对海马结构及功能的调节作用：在本课题的第一部分，我们就CRH对海马兴奋性突触传递过程及其分子机制展开研究。通过电生理学方法观察CRH对培养海马脑片的自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的作用；检测CRH对海马脑片、培养的海马神经元以及神经元和胶质细胞的共培养体系中突触标记物synapsinI和PSD95表达的影响；给予CRH两型受体的拮抗剂明确介导CRH作用的受体类型；ELISA法检测CRH对胶质源性信号分子，如BDNF、NGF等的调节作用，以进一步明确胶质细胞、胶质源性信号分子及受体参与CRH调节synapsinI和PSD95表达的机制。在本课题的第二部分，我们就糖皮质激素对海马神经元上的诱导的NMDA电流（INMDA）的快速调节作用及其机制展开研究。胚胎18天大鼠海马神经元上GR的表达水平明显低于原代培养的新生大鼠海马神经元，这是研究GC快速作用的良好模型。在此模型上，我们研究了皮质酮对海马神经元上INMDA的调节作用；分别应用糖皮质激素受体特异性的拮抗剂，G蛋白的抑制剂研究皮质酮的作用位点；通过免疫共沉淀，Westernblot，RIA以及ELISA等方法研究皮质酮可激活的细胞内信号通路；给予PKA、PLC、PKC等蛋白激酶的抑制剂，研究皮质酮调节INMDA的细胞内信号转导机制。主要实验结果如下：一、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）对海马突触发育的调节作用1、电生理学结果显示，CRH孵育海马脑片48h后，海马神经元的sEPSC的频率和幅度显著降低；提示CRH抑制海马兴奋性突触传递效率。2、荧光定量PCR结果显示，CRH处理后的海马脑片内突触前相关分子synapsinI和突触后相关分子PSD95的mRNA水平明显降低，呈剂量依赖关系；时间曲线显示，CRH作用后6h，synapsinI和PSD95的表达即下降，48h后，CRH的抑制效应达到最大；Westernblot结果显示，CRH处理海马脑片48h后，synapsinI和PSD95的蛋白水平明显降低；CRHR1的拮抗剂Antalarmin可以阻断CRH的抑制作用，但不能被CRHR2特异性的拮抗剂Astressin2B阻断；而针对CRHR2被激活后可促进synapsinI和PSD95的mRNA和蛋白的表达，与CRHR1介导的作用相反。3、CRH通过CRHR1促进培养海马神经元synapsinI和PSD95的表达，与脑片的结果不一致；当神经元与胶质细胞共培养时，CRH抑制神经元synapsinI和PSD95的表达，与脑片结果一致；提示胶质细胞参与了CRH对海马突触相关分子表达的调节。用CRH处理胶质细胞后的培养上清再孵育神经元，神经元的synapsinI和PSD95表达水平降低，且用含CRHR1拮抗剂的上清处理后的神经元的synapsinI和PSD95水平未发生改变，提示CRH可作用于胶质细胞的CRHR1，促进或改变了胶质细胞分泌的递质或细胞因子等，进而调节synapsinI和PSD95的表达。ELISA的结果显示，CRH没有显著影响胶质细胞、神经元和共培养系统的培养上清中BDNF水平；CRH促进胶质细胞培养液中NGF水平，不影响神经元培养液中NGF水平。外源性给予BDNF可促进共培养体系中PSD95的表达，同时给予CRH可逆转BDNF的促进作用，而BDNF对synapsinI的表达没有影响；CRH可抑制神经元与胶质细胞共培养体系中神经元的TrkA和TrkB受体的表达，酪氨酸激酶受体的抑制剂和TrkBIgG可模拟CRH的作用，抑制共培养体系神经元synapsinI和PSD95的表达。提示CRHR1被激活可影响胶质细胞分泌某种因子，抑制神经元TrkA和TrkB受体的表达水平，进一步抑制神经元synapsinI和PSD95的水平。而CRH究竟促进了那些因子的分泌，尚需深入阐明。4、CRHR2被激活后可直接抑制海马神经元synapsinI和PSD95的表达，与脑片的结果相反；当神经元与胶质细胞共培养时，UrocortinII促进神经元synapsinI和PSD95的表达，用UrocortinII处理胶质细胞后的培养上清再孵育神经元，也可促进神经元synapsinI和PSD95的表达，与脑片结果一致；提示胶质细胞及胶质源性递质或因子参与了CRHR2对海马突触相关分子表达的调节。ELISA的结果显示，UrocortinII促进了共培养系统的培养上清中BDNF水平，没有显著影响胶质细胞、神经元培养上清中BDNF和NGF的水平。UrocortinII不影响神经元与胶质细胞共培养体系中神经元的TrkB受体的表达，而促进了TrkA受体的表达；酪氨酸激酶受体的抑制剂可阻断UrocortinII对共培养体系神经元synapsinI和PSD95表达的促进作用。提示CRHR2被激活可影响胶质细胞分泌某种因子，抑制神经元TrkA的表达水平，促进神经元synapsinI和PSD95的水平。NGF是否参与CRHR2调节synapsinI和PSD95的表达尚需进一步明确。二、糖皮质激素对海马神经元NMDA受体的快速调节作用1、Westernblot结果显示，糖皮质激素受体（GR和MR）在原代培养的胚胎18天（E18）大鼠海马神经元上均有表达；与培养至第7天的新生大鼠海马神经元相比，胚胎18天大鼠海马神经元上GR的表达水平明显降低。2、全细胞膜片钳记录结果显示，原代培养的E18大鼠海马神经元静息膜电位为-53.5±9mV，膜电容为45.3±10.1pF（n=57）。当钳制电压为-60mV时，细胞外单独给予NMDA（10-4M+glycine10-5M）可在海马神经元上诱发出一内向电流（INMDA），并迅速达到峰值（Ipeak, Ip），5sec内衰减至稳定段（Isteady-state, Iss），稳定段与峰值的电流比值（Iss/Ip）为58.7±3％（n=57）。3、皮质酮作用2~4min可明显抑制海马神经元INMDA，呈剂量依赖关系；且皮质酮处理前后，INMDA的EC50值未发生明显变化，说明皮质酮不是通过影响NMDA与其受体的亲和力来抑制海马神经元INMDA。4、GR拮抗剂RU38486和MR的拮抗剂螺内酯均不能阻断皮质酮对INMDA的抑制作用；且胞内给予皮质酮对海马神经元的INMDA没有影响，当细胞外再给予皮质酮2~4min后，INMDA的峰值和稳定度均被明显抑制；另一方面，与大分子BSA耦联的皮质酮也能剂量依赖的快速抑制海马神经元的INMDA的峰值和稳定度，其效应与皮质酮相似，NMDA与其受体的亲和力也未受到影响，以上结果提示皮质酮对INMDA的快速调节作用不是由胞内的GR和MR介导，是作用于细胞膜实现的。5、胞内给予G蛋白的抑制剂GDP--S，可以完全阻断皮质酮对INMDA的抑制作用，提示，皮质酮通过激活胞内的某个G蛋白对INMDA进行调节。免疫共沉淀结果显示，皮质酮和Cort-BSA均可以激活海马神经元内的Gs蛋白；cAMP放射免疫测定显示，皮质酮和Cort-BSA还可以增加海马神经元胞内cAMP水平；另一方面，Western Blot结果表明，皮质酮和Cort-BSA均可以诱导磷酸化PLCβ3表达增加；ELISA结果显示，皮质酮和Cort-BSA可使神经元内IP3水平增加。这些结果提示，皮质酮可以激活海马神经元内Gs-AC通路以及Gq-PLC通路。6、膜片钳结果显示，当细胞外分别给予PLC的抑制剂U73122、IP3R的抑制剂2APB、PKC非选择性的抑制剂chelerythrine、PKCα/β亚基的抑制剂G6976，细胞内给予Ca2+的螯合剂BAPTA，均可以阻断皮质酮对海马神经元INMDA的抑制作用；而当细胞外分别给予AC的抑制剂SQ22536和PKA的抑制剂H89，均抑制海马神经元INMDA，不能逆转皮质酮对海马神经元INMDA的抑制作用。结果提示，皮质酮对INMDA的抑制作用可能涉及PLC及下游信号通路，而与AC/PKA通路无关。7、在体实验结果显示，大鼠海马CA1区记录到稳定场兴奋性突触后电位（fEPSPs），给予高频率刺激（HFS）可诱导稳定的长时程增强（LTP）3h以上；侧脑室注射皮质酮后，大鼠海马CA1区诱发的LTP效应被明显抑制，提示皮质酮抑制海马CA1区突触可塑性。结论：1、促肾上腺皮质激素释放激素抑制海马兴奋性突触传递过程。CRH通过CRHR1影响胶质细胞分泌某些因子，抑制与胶质细胞共培养神经元的TrkA和TrkB的表达，抑制synapsinI和PSD95表达；当CRHR2被激活后，也影响胶质细胞分泌某些因子，并促进神经元与胶质细胞共培养的TrkA的表达，进而促进synapsinI和PSD95的表达。胶质细胞及分泌的递质或细胞因子积极参与突触结构及功能的调控过程。2、糖皮质激素可以快速激活海马神经元内Gs-AC和Gq-PLC等多条信号转导途径；其中Gq-PLC及其下游的信号通路参与了糖皮质激素对大鼠海马神经元NMDA受体功能的调节；在体实验表明，糖皮质激素抑制大鼠海马长时程增强的诱导，提示应激时或糖皮质激素分泌过多时，可能导致海马依赖性的高级功能如学习记忆等损伤。